一、實驗原理

MTT實驗的原理依賴于細胞內琥珀酸脫氫酶的活性。這種酶能催化MTT分子在細胞內的還原過程，形成水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中?；罴毎哂写嗣傅墓δ?，因此能夠產生甲瓚結晶，而死細胞缺乏這種功能。二甲基亞砜（DMSO）被用來溶解細胞內的甲瓚結晶。通過酶標儀在490nm或570nm波長處測定甲瓚溶解后的光吸收值。

在一定細胞數量范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。因此，透過測定的光密度值（即OD值），我們能夠推斷出活躍細胞的數目。高OD值代表著細胞的活性較高，而低OD值可能意味著細胞數量較為稀少或者細胞的活性較為低下。在藥物毒性評估方面，高OD值則意味著藥物的毒性較小。

主要用途：

1、評估細胞活性和增殖能力：MTT實驗可用于評估細胞的活性和增殖能力。通過測量MTT還原產生的紫色產物的形成量，可以間接反映細胞的代謝活性和增殖狀態。

2、藥物篩選和藥物毒性評價：MTT實驗廣泛用于藥物篩選和藥物毒性評價。可利用MTT實驗來測試候選藥物的抗癌活性、抗炎活性等，并評估藥物對細胞的毒性和安全性。

二、實驗步驟（以貼壁細胞為例）

1、重懸細胞：將貼壁生長的細胞經胰酶消化處理，以獲得單個細胞的懸浮液。使用含有10%胎牛血清的培養基調整細胞懸浮液的濃度，以確保細胞在接種后能夠良好地生長和繁殖。

2、接種細胞：將每毫升細胞懸浮液中含有103至104個細胞的數量接種到96孔板中。每個孔加入200微升的細胞懸浮液，確保每個孔內細胞的均勻分布。

3、添加受試藥物培養細胞：將96孔板置于37攝氏度、5%二氧化碳的培養箱中培養，使細胞貼壁生長。隨后，加入不同濃度的藥物，培養時間根據實驗需要確定，一般為2至3天。

4、呈色：向每個孔中加入20微升的MTT溶液，使MTT的最終濃度為0.5毫克/毫升，繼續培養3至4小時。這將導致MTT濃度從5.0毫克/毫升降至0.5毫克/毫升，并使細胞內的活細胞能夠將MTT還原為紫色的甲瓚形成，吸取96孔板每個孔的培養液，每孔加入150微升DMSO，低速振蕩10min溶解結晶。

5、比色：使用酶聯免疫檢測儀測量每個孔的吸光度值。測量時，波長為490nm或570nm。

6、結果計算：

計算細胞增值率：測得各組的OD值后，求每組的平均值，再用以下公式計算各組的細胞增殖率：細胞增殖率（%）＝加藥組OD值/對照組OD值×100%

如對于100ug/ml的藥物，其增殖率=0.080/0.614=0.130。

三、注意事項

1、設置空白對照組：為了確保準確性，需要將空白對照孔（含有培養基、MTT和二甲基亞砜的孔）設置為零吸光度。這樣可以消除由培養基和試劑本身引起的背景吸光，使測量結果更為準確。

2、確定細胞接種濃度：細胞接種時的濃度選擇對實驗結果具有至關重要的影響。如果濃度過低，可能導致信號過于微弱，而濃度過高則可能因為細胞之間的相互干擾而干擾結果的準確性。應根據細胞的生長速度和特性，選擇適當的接種濃度。

3、MTT試劑的保存應避光，而在加入MTT試劑時，如果采用排槍或速度較快的操作，則不必過于擔心光照的影響。然而，若需要進行長時間的操作，則務必確保在避光條件下進行，以免光照對試劑產生影響。

如圖所示為MTT實驗測不同處理組的細胞活性