近年來，細胞治療產品作為創新生物制品中的明星，在國內呈現爆發式增長，以 CAＲ-T 細胞產品為例，從 2016 年到 2020 年，在中國臨床試驗注冊中心注冊的臨床試驗從 27 項增長到 357 項［1］; 截止2021 年底，全球已上市的 7 款產品中，我國占到了 2款。在這類熱門創新品種的藥學研究中，其特殊的生產工藝和質量屬性，對于傳統的質控方法提出了挑戰和更嚴苛的要求。以無菌質控為例，因細胞產品無法進行終端滅菌或除菌過濾，對工藝的無菌保障和過程控制要求更高，而目前研發/上市最多的自體型 CAＲ-T 細胞治療產品，又存在個體差異大、單批產量少、部分產品效期短、臨床需求緊迫，急需快速放行。但是經典的無菌檢查法，需要耗時至少兩周，成為制約放行時間的最大短板之一，其采樣方案又按照大規模生產場景設計，已無法滿足這類產品的過程控制和成品放行需求。

為了適應新品種新形勢，指導這類產品的藥學研究以及日常的產品質量控制，國家藥監局從多渠道相繼發布了《細胞治療產品研究與評價技術指導原則( 試行) 》、《CAＲ-T 細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》、《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則( 征求意見稿) 》等一系列指南，其中鼓勵開發和驗證、應用快速 /微量的新方法用于微生物質控放行，并將過程控制和放行檢驗結合，以滿足細胞制品特殊而迫切的要求［2-4］。2021 年 10 月 26 日，國家藥典委官網 公 示 了《細胞類制品微生物檢查法》草案［5］，本文從背景，注意事項等方面，對這類方法的應用規范進行淺析。

1、國內外標準進展情況結語與展望

各國藥典所收載的經典微生物方法已有數十年歷史，其基本原理依賴于人工判讀培養基中污染微生物的自然恢復生長，方法雖然久經考驗，但是與飛速進步的理化方法相比，試驗周期冗長，不論在生產過程控制還是在成品放行中都成為制約因素。為了彌補經典方法的短板，需要引入新的替代/快速方法，各國藥典也與時俱進地推出了一系列指南，除了適用于各類藥品的方法引進/評估/驗證/應用的通用原則外，還為創新生物制品配套了專用的方法和放行策略。

1. 1 替代/快速微生物方法引進/評估/驗證/應用的一般性原則

替代/快速微生物方法往往源自食品、臨床、環境等其他應用領域，而藥品的微生物質控項目通常屬于重要的安全性指標，因此，為了保障用藥安全，需確認新方法的可靠性，必須經過藥典體系下嚴謹的評估和驗證。

為了在制藥領域引進更新更快速的微生物檢測方法，各國藥典或行業協會在 2000 ～ 2012 年期間相繼新增了相關指導原則，包括美國注射劑協會( PDA) 第 33 號 技 術 報 告，美 國 藥 典 ( USP) 通 則1223，歐洲藥典( EP) 通則 5. 1. 6，《中華人民共和國藥典》( 簡稱《中國藥典》) 通則 9201，這些指導原則設計為可通用于所有藥品場景，為選擇、開發或引進、驗證和應用微生物替代方法提供了流程指導，包括應用原則、方法學參數的驗證要求; 而在 2013 年后，由于創新制品和新技術的不斷涌現，為了鼓勵并規范新方法的推廣，USP、EP 和 PDA 技術報告又進行了多次修訂，在技術原理、基于風險的 4Q 確認流程、驗證的統計學要求方面提供了更詳細的指南，《中國藥典》通則 9201 也正在修訂中［6-9］。

1. 2 適用于創新生物制品的替代方法和應用原則

創新生物制品在應用替代/快速微生物方法時，除一般性原則外，還需考慮其與傳統品種的差異，以選擇可靠的方法，并結合生產工藝和質量屬性的特殊性在驗證中增加要求，設計加速放行的策略。

EP 通則 2. 6. 27 《細胞制品的微生物檢查》自2007 年收載以來已經多次修訂，該通則主要介紹基于培養生長信號的自動化方法，但未限定具體原理;考慮細胞制品的特殊性和局限性，在取樣方案，質控菌株上的規定均與通則 2. 6. 1 的經典無菌檢查法有所差異，并建議了更靈活的培養溫度和培養基組合。該通則也允許采用其他方法，例如不經培養直接檢測的方法，或者結合預培養和直接檢測的方法，但這些方法需要按通則 5. 1. 6 的原則并結合通則2. 6. 27 對于細胞制品的建議進行方法學驗證和方法適用性試驗［10］。

美國 FDA 于 2012 年修訂了關于生物制品無菌標準的聯邦法規 21CFＲ. 610. 12 章節，雖然未給出具體 方 法，但 從 試 驗、試 驗 要 求、書 面 程 序、取樣、方法確認、復試程序、記錄和例外方面做了原則性規定，允許采用培養或者非培養的方法，鼓勵采用更先進和適用的檢測技術［11］。為了適應創新生物制品的新形勢，USP 于 2019 年 12 月正式發布通則 1071《用于無菌短效期產品放行的快速微生物檢查法———基于風險的方法》，適用于配藥無菌制劑、正電子發射斷層掃描( PET) 產品以及細胞和基因治療產品這類短效期產品，推薦了 6 類有應用前景的快速微生物檢查方法，并提出了基于風險的微 生 物 監 測 和 放 行 理 念［12］。隨 后 USP 于2020 年在其藥典論壇上發布了通則 72《基于呼吸的短效期產品放行用快速微生物檢查法》和通則73 《基于 ATP 生物發光的短效期產品放行用快速微生物檢查法》兩個公示稿，分別針對呼吸信號原理的方法和 ATP 生物發光原理的方法，在采樣方案，質控菌株等方面的規定均與通則 71 的經典無菌檢查法有所差異［13-14］。

2、《中國藥典》細胞類制品微生物檢查法的擬訂

國家藥典委于 2019 年立項了“無菌快速檢查法”( 課題編號 2019S11) 國家藥品標準提高課題，課題組選擇呼吸信號檢測技術作為評估對象，包括二氧化碳顯色、二氧化碳熒光和頂空壓力信號，覆蓋了主流的儀器平臺，參考《中國藥典》通則 9201 和國外指導原則［6-10，12-14］，對 3 種主流的儀器方法與經典無菌檢查法完成了比對驗證及評估［15］。根據研究結果，借鑒國內外相關標準經驗，完成了公示稿草案的擬訂。下文將就制訂草案時的考慮要點逐一進行介紹。

3、應用細胞類制品微生物檢查法時的考慮點

3. 1 基本原則

本法針對的細胞治療產品未經最終滅菌工藝處理，也不同于采用無菌生產工藝并進行除菌過濾的品種，并非傳統意義上的無菌制品，參考國外藥典經驗［10，12-14］，定名為微生物檢查法而非無菌檢查法。

在檢測方法選擇上，目前收載的呼吸信號檢測技術是應用較多的方法，其采用自動化的儀器實時監控微生物培養的呼吸信號，原為臨床檢測開發，主要用于對血液等體液樣本的快速微生物檢測，也應用于臨床干細胞庫檢測，該類技術也為歐美藥典所推薦［10，12-13］。

與經典的無菌檢查法相比，本法在適用場景上，

主要針對采用通則 1101 無菌檢查法時具有局限性的品種。在實施原則上，由于細胞治療產品工藝特殊，相對于傳統品種無菌保障風險更高，所以務必注意產品放行大前提是基于生產工藝和無菌保障水平、微生物污染風險、使用者獲益/風險等因素綜合考慮的結果，而不能僅依賴檢查法本身。此外，在引入這類方法前，應按通則 9201 的要求通過方法學驗證。

表 1 比較了本方法與經典無菌檢查法的主要異同之處。

3. 2 培養基

呼吸信號的方法一般采用儀器配套的培養基，在培養基的質控方法上，也參考通則 1101 的原則操作，但是在靈敏度試驗的菌種方面，需參考“方法適用性試驗”章節下的規定，菌種類型較通則 1101更多。

3. 3 方法適用性試驗和質控菌種

方法適用性試驗是指替代方法按通則 9201 通過驗證后，針對應用場景，也就是具體的細胞產品，進行產品加標試驗菌的回收試驗，用于考察產品成分對檢測的干擾。而如果實驗室在按通則 9201 開展驗證期間，已采用產品加標試驗菌的形式完成了各個方法學參數的驗證，則可不必再重復該品種的方法適用性試驗。

與經典方法的人工判讀不同，本法為儀器方法，在試驗中考察的干擾因素除了產品的抑菌成分外，可能還有產品成分對儀器的影響，例如對顯色或熒光信號的干擾而造成讀數異常。

這類方法的試驗菌除了沿用經典方法的 6 種試驗菌株外，還參考歐美藥典經驗［10，13］，根據課題組試驗結果［15］，增加了微球菌( Micrococcus sp. ) 、釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes) 、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes，現 改 名 Cutibacterium ac-nes) 3 種菌株，這也是考慮到細胞產品的起始材料從人體采集可能引入的潛在污染風險的情況［16］。其中的痤瘡丙酸桿菌為人皮膚上的優勢菌群，為生長緩慢的厭氧細菌［17］，如采用通則 1101 無菌檢查法收載的硫乙醇酸鹽培養基，接種量 ＜ 100CFU置于 30 ～ 35 ℃ 培養，往往需要 6 d 以上檢出，這對于呼吸信號方法也是一種檢出時間上的挑戰［15］。

除了上述標準試驗菌外，用戶實驗室還可根據環境采樣和歷史污染情況，酌情增加相應的試驗菌。

3. 4 供試品的檢查法

3. 4. 1 取樣方案

自體細胞治療產品產量極少，只有數十至數百毫升，生產工藝與大批量無菌灌裝的傳統制品差異極大，且成本昂貴; 而經典無菌檢查法的抽樣方案為大批量制品設計，無法適用于細胞治療產品的采樣。因此參考歐美藥典經驗［10，13］，本法設計了檢驗量要求，但需注意的是歐美藥典中規定的檢驗量為所有培養基接 種量的總和，而目前公示稿適當從嚴，規定的檢驗量為單種培養基接種量。

在取樣點上，如成品取樣不適用，應考慮選擇有代表性的替代取樣方案，例如從所處理細胞最后接觸的液體中取樣［10］。

3. 4. 2 檢查操作

供試品的處理和接種過程應遵循無菌操作規則，檢驗環境要求與通則 1101 無菌檢查法一致，供試品接種量與培養基的比例應符合方法適用性試驗確定的條件。

3. 4. 3 陽性質控

沿襲《中國藥典》對安全性項目從嚴控制的傳統，本法與通則 1101 無菌檢查法一致，保留了陽性對照的要求，同樣采用產品加標對照菌的方式操作。陽性對照菌建議選擇在方法適用性試驗中，發現干擾較為明顯的菌種。

由于本法為儀器方法，并采用儀器配套的商品化培養瓶，因此陽性對照也是判讀儀器穩定性的質控。在方法適用性試驗確立陽性對照時，應評估儀器對陽性對照瓶報告陽性時間的合理范圍，以建立日常工作的質控范圍。

3. 5 培養條件和結果判斷

3. 5. 1 培養時間

參考課題組試驗結果和歐洲藥典通則 2. 6. 27 的經驗，公示稿目前要求培養時間不少于 7 d［10，15］。如發現生長特別慢的微生物，或在方法適用性試驗中發現產品干擾難以完全消除的情況，也可酌情延長培養時間至 14 d。

3. 5. 2 培養溫度

在各國藥典的經典無菌檢查法中，往往將培養厭氧細菌兼顧需氧細菌的硫乙醇酸鹽流體培養基置于 30 ～ 35 ℃ 的高溫區，將培養真菌和需氧細菌的胰酪大豆胨液體培養基置于20 ～ 25 ℃ ，以期覆蓋高溫細菌并兼顧部分可能低溫生長的真菌。

呼吸信號方法來源于臨床檢測領域，為了加速培養適應人體體溫的寄生微生物，一般將儀器配套的厭氧培養基和需氧培養基均置于高溫生長，可較快獲得陽性結果。試驗結果［15］以及相關報道也表明［18］，在大多數情況下排除儀器檢測與肉眼觀察的因素差異外，高溫培養可明顯加速污染微生物的生長，確實更有利于實現快速方法快速檢出的設計初衷。

但是，在 GMP 生產環境中也可能出現偏好低溫生長的真菌，例如青霉屬，在高溫培養條件下反而回收不利。雖然真菌污染在 GMP 生產環境中檢出污染的幾率相對較小［19］，而其中偏好低溫真菌的污染比例可能更低，但如出現真菌污染也是一個不易消毒清潔的風險點。因此，實驗室應考慮生產工藝的無菌保障水平和污染風險，評估是否需要增加低溫培養或采取其他的補充檢驗措施［18，20］。

考慮上述因素和國外標準經驗，公示稿目前對培養溫度選擇做了較靈活的提示，以供不同用戶實驗室選擇決策。

3. 5. 3 培養觀察和結果判讀

本法雖然為儀器方法，人為判定干擾較少，但是儀器方法本身也可能存在一定的假陽性或假陰性幾率，因此為確保用藥安全，在結果判讀時，也需要進行目視觀察: 當兩種方式結果一致時可直接做出判讀; 而當兩種方式結果矛盾時，應按照公示稿的提示進行后續確認試驗。

4、小結

細胞治療產品為微生物污染風險較高的產品，原因在于: ( 1) 其涉及生產物料繁多; ( 2) 起始材料采集的無菌控制有限、生產流程涉及上游質粒和病毒等載體制備、臨床到 GMP 生產場地往返的細胞制備; ( 3) 細胞供體本身可能帶有病原微生物; ( 4) 生產中又缺乏除菌工藝。同時又由于臨床需求急迫、效期短、產量小、成本昂貴，因此在質控上需要采用更快速靈活的方法。

正如傳統制品的無菌性不能依賴于無菌檢查，細胞制品的無菌保障也絕非依賴于快速/替代微生物檢查法，而檢查法的結果報告時間亦不能理解成等同于產品的放行時間。

細胞治療產品無菌放行的決策源于無菌保障工藝的設計、驗證和實施; 源于對從起始物料開始對外源污染風險的控制; 此外，除了成品的微生物檢測和實時讀數外，還可根據工藝特點，在過程控制中將質控點前移檢測，這些工作配合使用者的獲益/風險考慮，有利于做出最終放行的決策［21］，同時也可以將快速/替代方法或平行實施的經典無菌檢查法繼續培養至14d，如發現污染，應及時鑒定并通知臨床醫生，為患者及時采取有效治療措施提供依據。

本公示稿收載的方法為目前較多采用的呼吸信號原理，這類原理的方法與經典方法比較的驗證案例在國外已有較多同行評議的文獻報道，涵蓋國外主流的儀器平臺［13］; 而國內目前公開發表的文獻還相對較少，國內實驗室積累的經驗較少，類似原理的國產儀器也在研發中，考慮到涉及安全性質控，因此在當前階段，在應用該類儀器方法前，用戶實驗室應參考通則9201的要求對方法進行驗證后，再參考公示稿的要求應用。

除了基于培養生長的呼吸信號方法，核酸擴增方法、ATP 生物發光方法等直接檢測技術，或者將這些直接檢測技術與培養方法結合，也是值得關注的候選技術，有理由期待會有更多改進和創新的微生物替代方法進入藥典體系。

除了細胞治療產品，在傳統的生物制品領域，例如高風險的疫苗、高附加值的重組藥物，這些品種也存在生產工序多，生產周期長，起始物料復雜，反應條件溫和，易于污染微生物的情況。因此，國外已有將快速/替代微生物方法應用于疫苗等傳統生物制品過程控制和成品檢定的報道［22］。它能實現對微生物污染的近實時檢測，掌握工藝現狀并縮短等待時間，在更好地監測工藝過程的同時降低損失風險，也將成為國內推廣快速無菌檢查方法的潛在領域。