熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。跟小析姐一起來學(xué)習(xí)下熒光免疫技術(shù)吧~

由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。 

熒光

（一）熒光的產(chǎn)生 

一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。 熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。 可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

（二）熒光效率 

熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。 

熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度） 

發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也最大。 

（三）熒光的猝滅 

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。 

（四）熒光物質(zhì) 

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有： 

1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下： 

熒光素標(biāo)記

(一)　原理

目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達(dá)明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價(jià)結(jié)合，標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。

(二)　操作步驟

將純化的IgG抗體對(duì)PH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，透析后抗體液移入小燒杯中

　　　　　　　↓

稱取適量IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)使終濃度為1mgFITC／1mlDMSOFITC／IgG比例:如IgG濃度為1mg／ml，F(xiàn)ITC／IgG比例約為50μgFITC／mgIgG；

如IgG為5～10mg／ml，則比例為25μgFITC／ml IgG

在10ml小燒杯中先放入抗體

　　　　　　　↓

按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中

　　　　　　　↓

將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h

　　　　　　　↓

用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素，先用25ml PBS淋洗G25柱

　　　　　　　↓

收集PBS洗脫第一個(gè)熒光素結(jié)合蛋白峰，測(cè)定F／P比值。第二個(gè)熒光素峰為游離熒光素

　　　　計(jì)算:

　　　　　　　　　2.87×A495

　　　　F／P＝───────────

　　　　　　　　A280-0.35×A495

　　　　合適的F／P值為2～4。

(三)　試劑器材

1.　純化的多克隆抗體或單克隆抗體。

2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。

3.　PBS、DMSO

4.　PH9～9.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸餾水至500ml。

5.　PD10柱(Sephadex G25柱)

6.　磁力攪拌器，紫外分光光度計(jì)等

(四)　注意事項(xiàng)

1.　FITC保存于4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開蓋稱取，以避免潮解。

2.　FITC-DMSO液要臨用時(shí)配制。

3.　碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。

熒光標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的很多方面，主要應(yīng)用有：自身免疫性疾病方面的檢測(cè)、細(xì)菌診斷、寄生蟲診斷、病毒學(xué)診斷等的檢測(cè)。