1前言

目前市面上商品化的反相色譜柱各式各樣，時常讓實驗人員眼花繚亂，產生幸福的煩惱，很難快速選擇合適的色譜柱。通常我們會從鍵合相類型、鍵合相在硅膠表面的覆蓋率、是否封端、封端類型等方面去選擇反相色譜柱。本文從已表征色譜柱的參數，通過量化數值去快速選擇合適的反相色譜柱。

2色譜柱表征體系

色譜柱表征體系通過量化分析色譜柱中影響溶質保留行為的特征，對色譜柱進行分類，從而指導實際工作中色譜柱的選擇。有效的色譜柱表征體系應具有以下特點：

（1）考慮了對色譜柱選擇性有貢獻的所有因素；（2）每一個柱參數表征一種專屬的溶質—色譜柱相互作用；（3）能夠得到大部分商業柱的色譜柱參數；（4）對于特定色譜柱，不同實驗室能夠得到 可重現的色譜柱參數；（5）在特定實驗條件下測定的色譜柱參數能應用到任何流動相或任何柱溫下的分離。

目前國際上比較成熟的色譜柱表征體系有4個，分別是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色譜柱工作小組領導完成，詳見表1。其中，由Snyder等基于反相色譜保留機制提出的疏水消除模型，理論基礎較堅實，對色譜柱選擇性的表征較全面，與其余3個體系的柱參數本質上并無區別，均取自代表性溶質的保留值，參數測定方法簡便，實現選擇相似或者不同色譜柱的目的。由于USP網站公開常用色譜柱的參數，USP方法表征的色譜參數更方便我們篩選色譜柱。

表1 色譜柱參數及其含義

3色譜柱表征參數

對于反相色譜柱選擇性主要為疏水作用、立體選擇性和氫鍵作用，還有一些二級作用，比如：離子交換、金屬螯合作用等。

3.1 USP數據庫

疏水作用（Hy）：通過同一流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行乙基苯測試，考察乙基苯的保留因子，保留因子越大，色譜柱的疏水作用越強。

立體選擇性（TFA）：通過同一流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行阿米替林測試，考察阿米替林的拖尾因子，由于阿米替林特殊的立體結構，拖尾因子越小，色譜柱的立體選擇性越強，同時硅醇基作用較弱。

金屬雜質含量（CTF）：色譜柱中會殘留少量的金屬離子，一般金屬離子會與喹啉結構發生螯合作用，導致峰拖尾，故喹啉拖尾因子越大，色譜柱金屬雜質含量越大。

氫鍵作用（CFA）：阿米替林是堿性化合物，在酸性或中性條件下呈離子態，保留因子較小，保留主要依靠氫鍵作用，阿米替林保留因子越大，色譜柱氫鍵作用越強。

表2 阿米替林和喹啉結構式

3.2 PQRI數據庫

疏水作用（H）：通過同一流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行戊基苯和丁基苯測試，考察乙戊基苯和丁基苯的保留因子之比，比值越大，色譜柱對不同碳鏈長度化合物的選擇性越強，疏水作用越強。

立體選擇（S）：區分平面結構（三苯乙烯）和空間體積較大的結構（鄰三苯基）的能力。前者與后者保留因子之比體現空間選擇性，比值越大，立體選擇越強。圖示見圖1。

氫鍵作用（A或B）：通過同一流動相體系，在不同的反相色譜柱測試咖啡因和苯酚保留因子比值，數值越大，氫鍵作用越強。PQRI數據庫進一步將氫鍵能力描述為氫鍵酸度(A)、非電離硅烷與堿相互作用的能力和氫鍵堿度(B)、硅膠表面或鍵合相與酸性分析物的特性進一步相互作用的能力。

離子交換作用（pH2.7或7.0）：在流動相pH2.7和7.0下，分別測試苯芐胺和苯酚保留因子之比，比值越大，說明色譜柱區分極性化合物的能力越強。

固定相類型：A——A型硅膠，無定型硅膠，表面殘余大量硅醇基；B——B型硅膠，球形高純硅膠，目前主流硅膠類型，硅醇基殘留少；E——鍵合相含嵌入極性基團的固定相；phenyl——聚苯乙烯聚合物固定相；F——氟代固定相。

對比USP與PQRI的數據信息，PQRI數據庫的色譜柱參數更加全面反應色譜柱的性能。

圖1 疏水作用、立體選擇、氫鍵作用和離子交換作用的圖示

4案例

目前色譜柱公司均推出各自方法開發的推薦色譜柱包，比如Waters公司推出經濟實惠型的色譜柱包：XBridge C18，XBridge Shield RP18、CORTECS C18+、Xbridge Phenyl和Xselect HSS PFP。通過PQRI數據庫檢索，如下表。

表3 上述色譜柱參數

從上表可知：

①疏水作用CORTECS C18+＞XBridge C18＞XBridge Shield RP18/Xselect HSS PFP＞XBridge Phenyl，XBridge Shield RP18的鍵合相含內嵌極性基團，碳載量相對低，苯基柱和五氟苯基柱比C18柱碳載量低，故H值較低。

②空間選擇性，Xselect HSS PFP較為突出，CORTECS C18+最低，S值反應硅膠表面鍵合相的密度。Xselect HSS PFP柱的空間選擇性強。

③氫鍵作用，XBridge Shield RP18和苯基柱最突出，XBridge C18最低，XBridge Shield RP18內嵌的酰胺基團和苯基與酸性和堿性分析物均有強偶極作用。這兩根柱子可以分離強極性化合物。

④離子交換作用，在酸性和中性條件下五氟苯基柱的離子交換能力突出，對苯環不同取代物的相似物質選擇性強，CORTECS C18+柱在中性條件下離子交換作用強，其對酸性化合物增強保留，對堿性化合物有較好的峰型。

這四款反相色譜柱，各具特點，在分離不同特點的化合物時具有各自的特長，在方法開發中他們可以互補，可提高柱篩選的效率。

在實際工作中，有好多方法有指定的色譜柱，但我們在研究過程中，會找性能相似的色譜柱作為備選色譜柱?？梢酝ㄟ^PQRI數據庫查找與目標色譜柱相似的色譜柱，只要F值在3以內，均可嘗試。比如方法中規定選用Nucleodur C18 Gravity，一個小眾品牌的色譜柱，如果想替代之，可從數據查詢與之類似的色譜柱。見下表。

表4 與Nucleodur C18柱性能相當的色譜柱

從上表可知：與Nucleodur C18 Gravity相似的色譜柱很多，有我們熟悉的Waters Cortecs C18、島津Inertsil ODS-2和Kromasil C18，并且完全替代Nucleodur C18 Gravity使用的概率很高。

5小結

反相色譜柱表征體系逐漸成熟，并且廣泛地用于篩選色譜柱。根據大多待測物質性質結合色譜柱參數可快速篩選目標色譜柱。但色譜柱表征體系針對特定樣品中難分離物質對的分離，還有待細化。對于結構類似待測物的分離只和部分關鍵色譜柱參數有關。因此，如何更好地研究難分離物質與關鍵色譜柱參數的關系，并針對品種在液相色譜方法中規定關鍵柱參數的最佳范圍，還需要研究者的不斷探索。