我國體外診斷產業正處于蓬勃發展的階段，積累了一定的技術基礎，但尚存在產品設計開發過程不規范等問題。如何在符合我國國情的前提下，指導企業科學合理的開展體外診斷試劑的設計和開發成為亟待解決的問題。這就要求企業不僅應重視臨床性能的評價，也需系統而全面地進行分析性能的研究，以綜合評價產品的安全有效性;其中關鍵的項目之一為定性檢測試劑的陽性判斷值或定量檢測試劑的參考區間。正確的建立體外診斷試劑的陽性判斷值或參考區間會大幅提高臨床評價指標滿足驗收標準的概率，反之可能對臨床試驗結果（如靈敏度和特異性）造成不利影響。

1、陽性判斷值或參考區間確定的總體要求

體外診斷試劑的陽性判斷值或參考區間研究是臨床前研究的重要組成部分之一。生產企業應當在主要原材料和生產工藝經過選擇和確認、質量管理體系得到有效控制并且保證產品質量穩定的基礎上，制訂方案并相應的開展研究。試驗人員應經過必要的培訓，熟悉檢測系統的操作程序、樣本制備方式和試驗方案，嚴格執行校準和質量控制方法,定期對設備進行維護和保養。建議使用多批產品，采用科學合理的試驗方法確定產品的陽性判斷值或參考區間。在對結果進行數據檢查后，選擇適當的統計方法進行檢驗或分析，并形成報告。樣本數量需符合統計學要求。

2、陽性判斷值或參考區間確定的方案和采用的樣本

2.1陽性判斷值或參考區間的特點

陽性判斷值或參考區間反映了體外診斷試劑區分受試者目標狀態特征（如健康或疾病）的性能,在鑒別良性與惡性疾病、確定疾病進程、監測治療效果、判定預后情況、指導臨床處置或者影響醫療決策制定等方面具有重要意義。陽性判斷值或參考區間的正確制定能夠充分體現產品的臨床表現，如區分正常/異常的能力或診斷準確性。

2.2陽性判斷值或參考區間確定的方案和采用的樣本

陽性判斷值或參考區間的確定過程包括建立與確認兩個階段。建議區分訓練集和驗證集，分別納入不同的樣本子集進行研究。必要時應考慮充分覆蓋不同亞群的樣本。注意納入研究的樣本應來源于產品的適用人群以及相關適應癥。注意應采用臨床真實樣本進行研究，明確樣本的來源、類型和背景信息（如年齡、性別、干擾因素等）；如檢測結果有明確的疾病指向，還應包括臨床診斷信息。應從預期適用人群中選擇具有代表性的目標人群（如不同組織病理類型或分期的腫瘤、其他相關的良惡性疾病），并從臨床意義的角度考慮其中可能存在的亞群,對各個亞群檢測值的差值進行統計學檢驗，如存在顯著差異，則應針對亞群分別建立參考區間（如不同種族、性別、年齡、目標狀態）。必要時對不同亞群（如不同分期的肺癌患者）樣本分層進行統計分析以確定各個亞群的陽性判斷值或參考區間。可具體比較不同臨床背景特征的適用人群，不同種族或地域人群,具有流行病學差異的人群以及不具有可比性的樣本類型之間的差異,必要時分別建立陽性判斷值或參考區間。

另外，建議充分考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標人群的代表性，在臨床試驗階段進一步確認陽性判斷值的準確性。對于定量檢測試劑，如為具有相同的地理區域以及人口統計學特征（包括種族）的目標人群，在方法學比較研究結果一致的前提下，可考慮轉移同類產品的參考區間。

3、陽性判斷值或參考區間確定推薦的研究方法

3.1定性檢測試劑

方法使用具有統計學意義數量的受試者樣本，采用受試者工作特征曲線（ROC)的方法確定陽性判斷值。樣本來源應為該檢測項目結果應用的代表性人群，并參照臨床診斷信息或者對比方法的檢測結果進行陰陽性判定。建議納入陰陽性比例相似的樣本進行研究,無需選取反映實際發病率的樣本。在實際應用中，還需考慮檢測結果與臨床進程相關性的研究,不僅是與診斷結果一致性的研究。另外，建議申請人從臨床意義的角度出發，合理設定灰區范圍并詳細說明確定的依據。注意明確對于灰區結果的后續處理措施，如進行復測后確認或者其他試劑確認等。

3.2定量檢測試劑

可根據數據的分布形式，采用非參數統計法或者參數統計法。方法可使用至少120個來自目標人群的受試者樣本，采用非參數統計方法建立參考區間（如適用，包括90%或95%置信區間）。建議基于嚴格的人群人選標準，排除檢測項目潛在異常的人群，入選健康正常人樣本建立參考區間。可使用調查問卷評估各受試者的健康狀況。在實驗室、分析系統（方法和儀器）、地理區域或人群存在一個變量的情況下，可考慮轉移分析物的參考區間。轉移參考區間的方法可使用至少20個受試者樣本進行評價，并在多于2個樣本超出參考區間范圍的情況下納入更多的樣本進行驗證。如無法轉移，建議建立參考區間。

4、不同方法學產品的舉例說明

4.1采用酶聯免疫分析技術的檢測試劑

(1)確定臨界值中的n數值以及陰性樣品A值的標準差（臨界值=陰性樣品平均A值+nx標準偏差）；

（2)使用臨床樣本驗證臨界值，包括陰性樣本和陽性樣本。推薦采用ROC曲線法,納入一定數量的弱陽性樣本進行驗證。

4.2基于實時熒光PCR等方法的沙眼衣原體和/或淋病奈瑟菌核酸檢測試劑

對于熒光實時PCR方法即為用于結果判讀的Ct值的確定，包括確定基線閾值（threshold)和閾值循環數（Ct)的研究等。樣本來源于各種可能接受沙眼衣原體和/或淋病奈瑟菌感染檢查的人群，包括尿道拭子、宮頸拭子或陰道拭子、尿液或其他泌尿生殖道樣本。建議樣本總數不少于100例，注意納入一定數量的弱陽性樣本進行研究。如采用稀釋方式獲得低濃度樣本,應同時考慮基質效應的影響，建議采用臨床陰性樣本作為稀釋基質。另外，建議充分考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標人群的代表性有限（如不能充分覆蓋泌尿生殖道樣本中的干擾物質），進一步通過臨床評價驗證和確認陽性判斷值的準確性。

4.3基于免疫化學發光等方法的人細小病毒B19IgM/IgG抗體檢測試劑

申請人應考慮不同地理區域流行病學背景以及免疫缺陷人群、免疫抑制人群與正常人群之間的差異，選擇具有代表性的樣本建立陽性判斷值。試驗所用樣本來源還應考慮到年齡（成人或兒童）、不同的感染階段和晚期）的影響。建議樣本總數不少于l〇()例，注意納入一定數量的弱陽性樣本進行研究。另外，建議充分考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標人群的代表性有限（如不能充分覆蓋血液中的干擾物質），進一步通過臨床評價驗證和確認陽性判斷值的準確性。

4.4基于熒光原位雜交法的HER2基因擴增檢測試劑

可參考最新版臨床指南性文件建立陽性判斷值，并采用具有統計學意義數量的樣本對判讀規則以及預設陽性判斷值進行確認。應包含HER2擴增、HKR2無擴增以及一定數量陽性判斷值附近的組織樣本，包括HER2/CEP17熒光信號總數比值在2附近（1.8?2.2),或者每個細胞的平均HER2拷貝數在4?6附近的樣本。首先設定檢測結果重復性較好的目標，即HER2平均拷貝數或者HER2平均拷貝數/CEP17平均拷貝數的標準差/變異系數范圍驗收標準，確定初始統計細胞區域和數量，并在結果不確定時納入更多區域或數量進行統計。然后建議參照組織病理學特征或者1HC結果確定可能存在擴增的浸潤性乳腺癌/胃癌區域，選擇細胞核大小一致、胞核邊界完整、DAP染色均一、細胞核無重疊、熒光信號清晰的細胞，隨機計數2個區域中的至少20個細胞，并對結果進行統計分析。

4.5基于免疫組織化學法的雌激素受體、孕激素受體抗體試劑

可參考最新的國際、國內診療指南等相關文獻資料。并對產品的染色特點進行研究，包括陽性樣本中不同類型細胞的著色顏色、染色部位及不同強度陽性組織的染色特點等。注意納入充分覆蓋不同染色強度、不同陽性細胞百分比及ER/PR陰性的乳腺癌樣本進行包含染色位置，染色強度和陽性細胞百分比數的評價，并明確樣本的背景信息。

4.6基于高通量測序法的胎兒染色體非整倍體（121、1'18、113)檢測試劑

在大樣本量以及數據符合正態分布的情況下，可采用Z-值（Z-sc〇re)算法確定孕婦外周血血漿中胎兒游離t)NA的數量，其中Z-值反應的是當前數值距離平均數的相對標準距離，Z-值的應用條件為大樣本量以及數據符合正態分布。

4.7多個目標基因聯合檢測試劑

例如包含多個目標基因的腫瘤相關基因甲基化檢測試劑，可分別確定不同單個目標基因和內參基因Ct值的差值或者拷貝數的比值，并對結果進行陰陽性判定。在此基礎上，采用邏輯回歸方程算法以及R0C曲線法，對Ct值進行回歸分析擬合分析,具體為賦予各個自變量不同的加權系數并計算總體分值。再根據擬合值繪制R0C曲線，選擇約登指數最大值點或者平衡臨床性能最優的靈敏度和特異性界值，從而確定陽性判斷值。如產品的臨床適應癥為肝癌，應至少納入正常健康人、不同類型肝炎病毒感染引起的肝炎、肝纖維化、肝硬化、不同類型肝炎病毒感染引起的肝癌（包括不同分期）、其他類型原發性肝癌、轉移性肝癌、其他類型消化道癌癥（如胃癌、腸癌）、其他相關的良惡性疾病患者的樣本建立陽性判斷值。上述樣本應分為訓練集和驗證集，分別包含數百例樣本，以保證算法模型的可靠性。另外，建議進一步通過臨床評價確認陽性判斷值的準確性。

針對產品設計開發過程中存在的科學合理性不足的問題,必要的解決手段之一是指導企業如何規范并高效的開展臨床前研究，從而提高臨床試驗成功的可能性。本文在對目前我國相關產品注冊申報中存在的問題以及審評工作中存在的難點進行全面梳理的基礎上，對體外診斷試劑陽性判斷值或參考區間確定的要點進行了初步探討。預計將幫助生產企業更加科學合理地建立申報產品的陽性判斷值或參考區間，相應地大幅提高產品設計開發的效率以及臨床試驗成功的概率。期待與各方協作探索更加優化的產品評價路徑和方法，共同努力提高相關產品的研發效率以及提升研究質量。