在藥物的開發周期內, 隨著體內和體外研究經驗和數據的積累, 溶出方法將不斷地被重新評估和完善, 并在實現合理的簡化后, 用于終產品的日常質量控制。

 

溶出檢查的最終目的是反映和控制藥物制劑的體內溶出/釋放行為。因此, 無論在藥物產品的開發階段還是常規的質量控制階段, 均應使溶出方法具有一定的體內外相關性 (in vitro-in vivo correlation,IVIVC)。

 

然而當前有部分溶出方法并未充分考慮IVIVC, 使其僅僅成為藥物體外的一種質量控制手段,不能真實反映藥物體內釋放情況。對于某些特殊劑型(緩釋制劑等) 或特殊藥物 (治療窗較為狹窄), 其釋藥特性與其有效性和安全性密切相關, 體外釋放檢查必須準確反映和控制藥物體內釋放情況, 對于該類藥物, 建立具有體內外相關性的溶出檢查方法和溶出度標準意義重大。

 

建立一種溶出度實驗方法, 需要考慮多方面因素。

 

本文通過查閱國內外藥檢機構關于建立和驗證藥物溶出方法的最新指導原則和相關文獻, 結合研究經驗和認識, 綜述了普通口服固體制劑溶出方法建立和溶出度標準制定的常見問題及研究進展。

 

1 對藥物活性成分和劑型特征的考察

 

建立溶出方法前, 應對藥物活性成分的物理化學性質進行研究和考察, 包括其同質多晶型、粒子大小和分布等, 了解藥物的濾膜濾過性及在不同介質和pH 條件下的溶解度和穩定性, 并結合藥物的制劑學特征, 合理地選擇溶出裝置、溶出介質及用量等。

 

1.1 過濾性考察

 

溶出樣品的過濾處理, 對于取得準確的實驗結果至關重要。過濾的目的是將未溶解的藥物或輔料從溶液中去除, 防止未溶出的藥物顆粒繼續溶解導致實驗偏差。過濾性考察應重點研究不同材質和規格的過濾材料對藥物的吸附性、濾過性及樣品的前處理方法等, 以確定合適的過濾條件。

 

1.2 測試原料藥在不同介質中的溶解度和穩定性

 

不同溶出介質的pH、緩沖體系、表面活性劑 (針對水難溶性藥物的制劑) 對原料藥的溶解度和穩定性往往有不同的影響。

 

溶解性是通過測試藥物在不同溶出介質中的飽和溶解度得出的。通常情況下, 不用有機溶劑作為溶出介質, 但對于某些特殊藥物, 在合理論證后可以考慮使用。

 

Vignaduzzo 等開發芬苯達唑−吡喹酮復方膠囊的溶出度實驗方法, 分別考量芬苯達唑和吡喹酮在水、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇等溶劑中的溶解情況, 發現兩藥在水中的溶解性均很差, 加入十二烷基硫酸鈉 (SLS) 不能得到明顯改善,最終選擇了水−醇混合液作為溶出介質。

 

穩定性也應重點考察, de Souza Anselmo 等分別選用Tween-80和SLS 兩種表面活性劑對難溶性藥物葉黃素片進行溶出研究, 相比Tween-80, SLS 明顯影響葉黃素的穩定性。推測原因, SLS 是陰離子表面活性劑, 其所攜帶的電荷可以促進葉黃素分子的氧化, 從而加速其降解。

 

1.3 確定溶出介質及用量

 

溶出介質對藥物的溶出行為有重要的影響, 溶出方法建立中應重點關注溶出介質的選擇。介質的成分和體積是依據藥物的溶解度和穩定性實驗、藥物制劑的制劑學特征和預期的體內溶出環境而確定的。

 

常用的溶出介質見表1, 一般采用pH 1.2～6.8 的水性介質, 特殊情況下, 可采用高pH (一般不超過pH 8.0)的溶出介質。建立溶出方法, 要求實現藥物溶出的漏槽條件, 所謂漏槽條件是指溶出介質用量至少達到使制劑中原料藥飽和溶解所需介質體積的3 倍, 一般為500、900 或1 000 mL。對于某些水難溶性藥物,需要較大用量的表面活性劑或較大體積的溶出介質以實現漏槽條件, 而這樣往往會失去溶出方法的生物相關性。

 

 

這種情況下, 在合理論證后使用非漏槽條件也是可行的。一般不用純水作溶出介質, 因為其pH值和表面張力較難控制。膠囊劑在貯存過程中, 囊殼明膠可能發生交聯形成膜殼, 必要時需向介質中加入胃蛋白酶或胰酶, 便于藥物溶出。近年來, 一些生物相關介質越來越多地應用到藥物的溶出研究中, 如人工胃液和人工腸液等 (表2、3)。

 

不同類型人工胃液或人工腸液的組成和配制方法各不相同, 其可以分別模擬空腹和進食狀態下胃/腸液的組成、滲透壓和生理pH, 如空腹和進食兩種狀態下的胃液, pH 存在顯著的差異。將該類介質用于藥物溶出研究, 可以考察不同飲食狀態對于藥物溶出行為的影響, 更好地反映體內的實際生理條件。雖然漏槽條件對于藥物的溶出有重要的意義,但當前采用非漏槽條件的生物相關介質進行溶出研究正逐漸成為趨勢。 

 

 

 1.4 溶出儀器的選擇

 

溶出儀器主要是依據藥物制劑本身的因素和體外溶出特性選擇的, 通常應選用藥典收載的溶出裝置。

 

對于固體制劑, 中國藥典 (ChP) 收載了轉籃法、槳法、小杯法、槳碟法和轉筒法共5 種溶出方法, 其中籃法和槳法的裝置簡單、標準化程度高, 適用于大部分口服制劑; 小杯法可視為槳法, 適用于低劑量規格的固體制劑。

 

美國藥典 (USP) 則收載了籃法、槳法、往復筒法、流通池法、槳碟法、轉筒法和往復架法共7 種溶出方法。優先選用籃法和槳法, 對于這兩種方法不適用的藥物制劑可采用往復筒法或流通池法等。

 

往復筒法除了用于常規制劑外, 還用于咀嚼片和非崩解劑等。

 

流通池法的應用優勢在于緩控釋制劑和活性成分溶出度有限的速釋制劑等, 值得注意的是,該方法所提供的液流沖擊作用比較微弱, 使其不適用于黏度大、對機械攪拌作用依賴性高的藥物制劑。

 

常見溶出裝置的主要特征及適用劑型見表4。從生理學角度考慮, 口服藥物進入體內后的崩解/溶出及轉運和吸收是一個動態連續、同時進行的過程, 若能通過體外溶出檢查同時模擬這些生理過程, 便可實現藥物溶出/跨膜吸收的同步評價。

 

常規的溶出模式在藥物溶出/吸收的同步評價方面尚存在很多不足, 需要進行適當的改進以實現更好的生物相關性, 如基于槳法或籃法的體外雙相溶出模式理論上可以同步模擬藥物溶出/轉運過程; 或選用能全面模擬胃腸道生理結構和功能的新型仿生溶出系統 以更好地預測藥物的體內溶出/吸收情況。但選用該類裝置時, 應對其合理性做出說明。

 

 

2 溶出方法的建立

 

建立溶出方法, 首先應確定藥物的BCS 分類, 特別是對于速釋制劑。根據藥物的劑型特征, 判斷藥物進入體內后將遇到的生理環境, 盡可能使體外的溶出條件模擬體內的生理介質、生理pH 和胃腸蠕動等,確立體內相關性最大的溶出條件。溶出方法建立的過程包括對溶出介質的選擇和攪拌速率的摸索、采樣時間點/采樣方式的設置和對溶出過程的評估等關鍵環節。

 

2.1 脫氣

 

某些藥物制劑對于介質中溶解的氣體較為敏感,當有氣泡出現在藥物制劑或籃網上時, 可能妨礙藥物溶出。此外, 氣泡可以導致藥物顆粒緊貼在儀器壁上, 減少藥物與介質的接觸面積, 可能降低溶出速率; 黏附在藥物制劑上的氣泡則會增加藥物的浮力,可能增加溶出速率。低溶解度的藥物對于氣泡的干擾尤為敏感。

 

因此, 必要時需對介質進行脫氣處理。常用的脫氣方法包括加熱、過濾或真空抽濾等。當確定了合適的脫氣方法, 應將其記錄為溶出方法的一部分。

 

2.2 沉降裝置

 

某些藥物制劑 (尤其是膠囊劑) 在溶出介質中容易上浮, 這種問題在建立溶出方法時應予以考慮。沉降裝置被用來調節藥物所受的浮力, 通常用在槳法中防止藥物上浮, 保證其正常溶出。同樣, 沉降裝置也用于易黏在溶出杯上的片劑等。常見的沉降裝置見圖1。

 

 

2.3 攪拌速度

 

體外機械攪拌可以有效地模擬體內胃腸道生理蠕動和食物對藥物的摩擦作用等。對于多數藥物制劑, 溶出實驗應在溫和的條件下進行 (表4), 以保證溶出方法的區分性。對于籃法和槳法, 攪拌太慢或太快 (25～150 r·min−1 之外的攪拌速度) 均會導致混合作用不一致。

 

如果要建立IVIVC, 通過減少或增加儀器轉速可以使溶出數據更好地反映藥物的體內行為也是可行的, 但要控制方法的變異性。

 

往復筒法的攪拌作用受筒體往復運動和樣品在介質中相對運動的影響。流通池法中, 溶出介質的不同流動模式對藥物的溶出會有不同的影響, 常用流速為4、8 和16 mL·min−1, 其攪拌作用不僅與介質流速有關, 而且受流通池規格的影響。

 

2.4 研究設計

 

2.4.1 溶出實驗的時間對于速釋制劑, 溶出實驗的時間通常為30～60 min。

 

建立的溶出方法, 應以10 min 或更短的間隔取樣, 設置足夠多的取樣時間點來充分描述溶出曲線的上升和平臺階段。

 

緩控釋制劑的情況類似于速釋制劑, 但釋放時間更長 (8～24 h)。遲釋制劑通常需要相繼在酸性介質 (0.1 mol·L−1 HCl)和pH 6.8 緩沖介質中進行釋放研究。酸性階段的時間通常是2 h, 在緩沖介質中釋放時間類似于速釋制劑。總之, 溶出實驗應至少持續至藥物溶出/釋放基本完全。

 

2.4.2 觀察通過繪圖、拍攝照片或視頻來記錄藥物制劑的崩解和溶出過程是非常必要的, 對于崩解和溶出行為的宏觀觀察可以指示藥品處方或制劑工藝的變化, 這對于建立溶出方法和處方工藝的優化非常重要。

 

2.4.3 采樣方式和數據處理建立溶出方法, 對于取樣方式應作規定。

 

當攪拌速度非常慢時, 如籃法50 r·min−1, 應在溶出儀器中同一位置采樣, 避免可能存在的濃度梯度帶來實驗誤差, 取樣位置不能過分靠近轉軸或容器壁。

 

由于溶出模式不同, 溶出數據分為累積溶出數據和微分溶出數據, 其中累積溶出數據較為常見, 而對于流通池法開放式工作模式得到的微分溶出數據, 可用積分法將其轉換為累積數據形式, 以便溶出曲線的統計學比較。

 

3 樣品分析和操作自動化評估

 

3.1 樣品分析

 

溶出樣品處理和檢測是溶出實驗中的一個重要環節。過濾或離心操作可除去樣品中未溶出的制劑微粒, 避免其繼續溶出造成實驗偏差。

 

一般不采用離心法, 因為離心處理可能使樣品的上清液形成濃度梯度或pH 梯度, 導致檢測不準; 離心作用提供的能量也會使未溶出的藥物顆粒溶解量急劇增加。樣品檢測作為溶出實驗的一部分, 需對其摸索和優化以提高準確性。Vignaduzzo 等采用響應面分析法 (RSM)摸索了流速、pH 和有機相比例等色譜條件對高效液相 (HPLC) 法分離效能的影響, 確定了阿苯達唑−吡喹酮復方片溶出樣品HPLC 檢測的最佳條件。

 

3.2 實驗自動化評估

 

目前溶出實驗的多個環節都可以實現自動化,包括自動定時取樣、樣品處理、樣品檢測、設備清洗及溶出數據計算等。溶出儀器和實驗過程的自動化雖然減少了實驗者的工作量, 但儀器性能可靠性的問題可能會引入新誤差。

 

4 溶出方法的驗證

 

建立一種溶出方法后需要進行驗證, 主要包括對樣品分析方法和溶出過程的驗證, 為其用于日常檢驗提供依據。

樣品分析方法的驗證包括方法的專屬性、線性和范圍、精密度、準確性/回收率、耐用性以及溶出樣本和標準樣品的穩定性考察等; 溶出過程的驗證包括對其區分性和耐用性的評價。

 

具有良好區分性的溶出方法對藥物關鍵質量屬性的變化有較高的敏感度。一種可行的方法是通過制備兩批體外溶出行為不同的制劑樣品, 進行體內測試, 如果兩批樣品顯示了不同的體內行為, 則可認為體外溶出方法得到了驗證。對溶出方法耐用性的評價, 應考察溶出介質的組成 (緩沖鹽或表面活性劑、pH、溶解氣含量) 及體積、攪拌速率、采樣時間和溫度等因素發生微小變化對溶出結果的干擾, 該驗證是采用質量良好的制劑產品 (具有良好的含量均勻性和較為一致的溶出特性) 完成。

 

Abualhasan 等建立了蘆丁片體外溶出方法, 通過變更溶出介質的pH、樣品檢測的紫外吸收波長和不同實驗人員3 種因素, 應用方差分析法進行統計學檢驗, 驗證了新溶出方法的耐用性。該驗證有助于確定溶出方法中上述可變因素必須控制的范圍。

 

5 溶出度標準的確立

 

根據關鍵生物利用度實驗和/或生物等效性實驗批次樣品的溶出數據及藥品研發過程中的經驗,兼顧統計學處理的需要, 制定溶出/釋放度檢査方法和標準, 溶出度標準需具有一定體內相關性。

藥物溶出實驗結果被認為是與關鍵臨床試驗批次質量特性的“鏈接”。當處方和生產過程發生某些變化而顯著影響藥物的溶出行為, 最終影響體內生物利用度時, 溶出實驗和其驗收標準要能反映和區分這些變化。

 

響應面分析法是確定關鍵生產變量 (CMV) 與體外溶出曲線及體內生物利用度數據效應面之間相關關系的研究方法。關鍵生產變量包括可顯著影響制劑體外溶出的制劑處方、工藝、設備、原材料和方法等。

 

通過調節不同的關鍵生產變量, 制備兩個或多個樣品制劑, 并研究其體外溶出特征; 再對具有最快和最慢溶出度特征的樣品與標準制劑進行體內對比實驗; 最后測定和分析這些受試樣品的生物利用度及體內外關系, 該方法可有效地研究CMV 對藥品性能的影響, 為溶出度限度的合理制定提供依據。雖然美國食品藥品監督管理局推薦用響應面分析法制定溶出度標準, 但此方法的相關研究和應用卻很少。

 

5.1 速釋制劑

 

對于速釋制劑, 通過對完整溶出曲線的分析, 合理簡化后確立溶出實驗時間和驗收標準。速釋制劑的溶出度檢測包括單點檢測和多點檢測。

 

單點檢測:可作為常規的質量控制方法, 適用于快速溶出的高溶解性藥物制劑, 如ChP 關于對乙酰氨基酚片的溶出檢查, 僅設置了30 min 一個取樣點, 要求溶出量為80%。

 

兩點或多點檢測: 這種方法能反映制劑的溶出特征, 可作為某些水溶性差且溶出緩慢的藥物制劑常規質量控制方法, 如USP 關于卡馬西平片的溶出方法, 分別設置15 和60 min 兩個取樣點, 要求15min 溶出量在45%～75%、60 min 時不低于75%。

 

5.2 遲釋制劑

 

腸溶包衣劑是最常見的遲釋制劑。前文已提及遲釋制劑的溶出實驗分為兩階段, 每一階段都有相應的驗收標準, 通常至少應設置兩個取樣點。酸性介質

 

中的檢測為確保腸溶涂層的正常性能, 以保證在酸性環境下, 藥物不發生明顯的釋放; 在pH 6.8 緩沖介質中釋放標準類似于速釋制劑。

 

 

5.3 緩控釋制劑

 

緩釋制劑的溶出度測試通常持續時間更長, 一般至少應設置3 個取樣時間點。申報藥物審批時可能需要更多的取樣點。較早的時間點被用來檢測和防止藥物的劑量傾瀉效應; 中間時間點包含一個溶出率范圍 (溶出窗), 用來表征制劑的體外釋藥特性; 最后的時間點用來顯示藥物基本釋放完全。

 

而控釋制劑除以上3 點外, 還應至少增加2 個取樣點, 其釋放度范圍應小于緩釋制劑, 即對其釋藥特性有更嚴格的要求。對于該類制劑, 若能獲取人體生物利用度數據,可通過構建IVIVC 來確立溶出度標準。

 

5.4 多種溶出條件的檢測

 

根據藥物的治療窗、溶解性及滲透性的不同, 對體外溶出度實驗條件的要求也不同。對于某些特殊藥品, 需要在多種條件下進行溶出考察, 以有效地表征和控制藥物溶出/釋放特性, 確保藥品質量和用藥安全性。

 

例如, USP 關于鹽酸羥考酮緩釋片列出了兩種溶出測試, 各有3～4 個取樣時間點。還有很多關于速釋制劑和遲釋制劑多重溶出檢測的例子, 例如, USP 關于左甲狀腺素鈉片和泮托拉唑鈉遲釋片提出了4 種溶出測試。

 

6 體內外相關性

 

建立一種多點檢測的溶出度規范相對容易, 困難的是如何設置溶出標準中每個取樣點可接受的溶出量范圍。

在A 級IVIVC 的情況下, 可采用兩種方法 (卷積分和反卷積分法) 確定溶出度范圍。Roudier 等考察和對比了經典溶出度標準設置法和基于體內外相關性的方法, 得出基于IVIVC 的90%置信區間法更為可取, 這種方法考慮了藥物的個體內變異性, 但值得注意的是, 不推薦IVIVC 用于高變異性藥物。

 

緩釋、控釋和遲釋制劑均要求進行體內外相關性研究。鑒于藥物溶出檢查的最終目的是反映藥物體內行為的變化, 保證藥物體內溶出/釋放可控。

 

因此, 在藥物研發過程中, 應盡可能建立IVIVC, 并依據IVIVC 對藥物的溶出條件和溶出標準進行合理地完善和修正。

 

Deshmukh 等在依法韋侖研發的早期, 分別制備了兩種簡易劑型, 通過小鼠的體內藥動學研究和體外溶出實驗條件的摸索, 初步建立了A級IVIVC, 為后期正式的藥物劑型選擇和溶出方法的建立提供了數據參考。Lai 等建立了一種吸波面積法用于川芎組分片中整體成分IVIVC 研究, 為西藥或中藥復方制劑中多成分總藥物的體內外相關性評價提供了技術參考。

 

7 中/美藥典關于溶出檢查的規定

 

溶出方法的建立必須在法規允許范圍內進行。

 

ChP 在1985 年版引入溶出檢查法, 2015 年版已有獨立的章節對藥物制劑的崩解、溶出, 以及緩控遲釋制劑的釋放和IVIVC 建立作了介紹。

 

中國食品藥品監督管理局也相繼出臺了相關文件, 規定和指導藥物的溶出檢查。雖然ChP 和上述文件都涉及了藥物溶出方法建立的相關內容, 但尚未對溶出方法的建立和驗證進行詳細指導和說明。

 

而USP 目前是收載溶出度、釋放度方法最多、最詳盡的藥典, 其有專門的章節介紹了藥物溶出檢查、溶出方法的建立和體內外相關性研究等內容。雖然各國關于藥物溶出檢查的政策和規定不盡相同, 但總體趨勢向著趨于統一的方向發展。目前我國應加大對藥物溶出檢查的技術研究和政策引導, 建立一套更加健全的溶出度評價體系, 以期全面趕上世界先進水平。

 

8 結語和展望

 

一種合格的溶出檢查方法, 不僅要具有一定的準確性和重現性, 還應對質量不同的藥物制劑有適當的區分力。溶出度方法的區分效能代表其檢測處方和生產工藝的微小變化對藥物溶出行為影響的能力,建立具有良好區分效能的溶出方法對于水難溶性藥物顯得尤為重要。

證明一種溶出方法的區分效能是非常重要的。基于合理的體外溶出研究可以為藥物的體內生物等效性提供有力的數據支持。隨著計算機科學的發展, 將計算機技術和體外溶出檢查結合, 研究和預測藥物的體內生物等效性, 可能會成為未來研究的熱點。

 

Pan 等通過體外溶出的對比研究, 采用計算機軟件模擬技術建立了阿莫西林膠囊的IVIVC 模型,探究了具有不同體外溶出行為的制劑產品在體內的生理藥動學參數, 進而評估了國產阿莫西林膠囊的生物等效性。

 

對于一種藥物制劑, 如果能使溶出檢查實現體內外相關, 則采用溶出度實驗預測藥物制劑體內行為的質控意義就會顯著提高。當前的藥典溶出方法均為基于傳統裝置的單相溶出模式, 無法全面模擬體內的生理條件。

 

在體外構建可以同時模擬藥物體內溶出/吸收過程的仿生溶出系統和研究方法, 有望使溶出檢查實現更好的生物相關性。仿生溶出系統作為一類新興的生物藥劑學研究工具, 其在藥品研發和質量評價中獲得了越來越多的應用。

 

盡管此類系統目前尚存在“結構太復雜”和“實驗重現性差”等問題, 但相信隨著生命科學及藥劑學的深入研究和發展, 該類系統將成為未來藥物溶出檢查和IVIVC 研究的主要方向。