背景：

1.HPLC對(duì)雜質(zhì)限度較低的方法開發(fā)思路主要是提高與濃度相關(guān)參數(shù)（雜質(zhì)響應(yīng)一前提下）：如雜質(zhì)的濃度、進(jìn)樣體積等，但當(dāng)改變這些條件無法達(dá)到要求時(shí)只能尋求其他高靈敏(MS)的檢測(cè)器,但是開發(fā)一個(gè)質(zhì)譜的方法比較有難度，且不容易普及。

2．峰高和峰面積是HPLC中最為常見的兩個(gè)重要參數(shù)：峰高越高，代表著化合物有更好的信噪比；峰面積越大，在進(jìn)行定量限重復(fù)性研究時(shí)會(huì)越簡(jiǎn)單。

3.超高效液相色譜的原理主要是針對(duì)譜帶的展寬進(jìn)行了優(yōu)化：柱外管路進(jìn)行改進(jìn)（0.1mm內(nèi)徑）；色譜柱進(jìn)行改進(jìn)（多數(shù)將內(nèi)徑改為2.1mm，1.9um小顆粒）。

4.目前HPLC主要使用的色譜柱內(nèi)徑是4.6mm，如4.6*150mm；4.6*250mm規(guī)格等類型，相比較UPLC化合物峰的展寬會(huì)比較大，但是如果UPLC色譜柱在普通液相使用，一般儀器的壓力又無法耐受。

圖1

過程：

1.第一板斧：采用中間內(nèi)徑（3mm）色譜柱，提高雜質(zhì)峰高，縮短運(yùn)行時(shí)間

問題：方法開發(fā)時(shí)，使用YMC Triart C18（4.6×50mm，5μm）色譜柱，流速0.8ml/min,流動(dòng)相 0.1%磷酸溶液-[四氫呋喃：乙腈（1:2）]（10:90），發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)的響應(yīng)較低，靈敏度不夠，見圖1-A；

解決方法：根據(jù)UPLC提高柱效的理論，我們采用了內(nèi)徑小一個(gè)規(guī)格的色譜柱YMC Triart C18（3.0×100mm，3μm），其他條件不變；測(cè)定見圖1-B。

結(jié)果：雜質(zhì)峰高提高了近一倍，而且縮短了保留時(shí)間，提高了分析效率。

2.第二板斧：降低流速提高雜質(zhì)的峰面積

問題：經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)更換高效的色譜柱后只提高雜質(zhì)峰高，峰面積的響應(yīng)沒有變化（因雜質(zhì)峰面積較小時(shí)重復(fù)性不好，定量限不好做）；同時(shí)該色譜柱內(nèi)徑較小，導(dǎo)致柱壓過高，有超壓風(fēng)險(xiǎn)。

解決方法：根據(jù)紫外檢測(cè)器（濃度型檢測(cè)器）峰面積與流速的乘積為一常數(shù)這一理論，將流速降為0.6ml/min。

結(jié)果：雜質(zhì)峰面積得到提高，滿足了定量需求；同時(shí)也將降低了柱壓，進(jìn)一步提升了小內(nèi)徑色譜柱在普通液相中的應(yīng)用。

3.第三板斧：提高有機(jī)相比例，調(diào)整保留時(shí)間，進(jìn)一步提高峰高。

問題：流速降低雖提高峰面積，但導(dǎo)致雜質(zhì)保留時(shí)間延后。

解決方法：提高有機(jī)相比例為92%。

結(jié)果：經(jīng)調(diào)整流速和有機(jī)相比例后色譜圖見圖1-C，雜質(zhì)保留時(shí)間在和圖1-B一致的情況下，峰高和峰面積都得到了提高；同時(shí)也將降低了柱壓。

結(jié)論：

采用更換3.0mm內(nèi)徑色譜柱+降低流速+提高有機(jī)相比例三板斧思路將雜質(zhì)的峰高可以提高1-2倍，峰面積也得到增大（根據(jù)流速調(diào)整大小而改變），同時(shí)將分析時(shí)間縮短。

該思路在雜質(zhì)方法開發(fā)時(shí)運(yùn)用較為簡(jiǎn)單，只有三板斧，試下就知道效果怎么樣，可以應(yīng)用在液體制劑的遷移物方法開發(fā)、化合物的限度較低的方法開發(fā)，對(duì)于清潔驗(yàn)證方法開發(fā)也比較實(shí)用。