前  言

無論是新藥還是仿制藥中，手性化合物可謂使形影不離我們藥物研發(fā)的整個(gè)過程，互為對(duì)映異構(gòu)體的兩個(gè)化合物往往在藥理，藥效的實(shí)驗(yàn)過程中，會(huì)表現(xiàn)出對(duì)生命體征的明顯差異，因此在藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，確定單一有效構(gòu)型的含量顯得尤為重要，如何對(duì)其異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，涉及到手性物質(zhì)的方法開發(fā)，手性物質(zhì)的方法開發(fā)和有關(guān)物質(zhì)的方法開發(fā)略有差異，表現(xiàn)在分離原理，色譜柱選擇，流動(dòng)體系的選擇上面，今天我們來聊聊手性方法開發(fā)的小經(jīng)驗(yàn)，若有不同，歡迎指教。

一. 手性化合物性質(zhì)

手性方法的開發(fā)的研究，離不開對(duì)手性化合物性質(zhì)的了解，只有對(duì)手性物質(zhì)的性質(zhì)足夠了解，才會(huì)對(duì)分離原理有所掌握、對(duì)分析方法有所延展，下面就手性化合物的性質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的表述：

1）名稱的由來：何為手性化合物，顧名思義，像我們的雙手一樣可互相對(duì)映卻又不可以完全重疊，與之構(gòu)型不同的化合物互為鏡像的關(guān)系。

2）如何判斷是否為手性化合物：空間結(jié)構(gòu)是否具有對(duì)稱性，用于判斷對(duì)稱性的參數(shù)有對(duì)稱中心，對(duì)稱軸，對(duì)稱面，和交替對(duì)稱軸，其中對(duì)稱軸的有無對(duì)分子是否具有手性沒有關(guān)鍵性的影響，而凡具有對(duì)稱中心，對(duì)稱面和交替對(duì)稱軸的化合物都可以與其鏡像重合，均為非手性分子，反之，則為手性分子。但是平時(shí)的工作中還有一個(gè)簡(jiǎn)單的判斷分子是否具有手性方法，那就是手性碳原子的存在，一個(gè)碳原子上連著四個(gè)互不相同的基團(tuán)，空間上有兩種不同的排列結(jié)構(gòu)，這樣的碳原子為手性碳原子，凡是具有手性的化合物一定具有手性碳原子，但是反之，不成立，若是一個(gè)化合物具有兩個(gè)手性中心，那么此化合物不一定為手性化合物，可能為內(nèi)消旋體。

3）手性化合物的性質(zhì)差異：物理性質(zhì)方面來說，互為對(duì)映異構(gòu)體的化合物分子量，熔點(diǎn)，沸點(diǎn)，相對(duì)密度，折光率，溶解度，光譜均沒有任何的差異，物理性質(zhì)的差異表現(xiàn)在可以使偏振光的振動(dòng)方向發(fā)生偏轉(zhuǎn)，稱為旋光性，互為對(duì)映異構(gòu)體的化合物的旋光方向相反，但強(qiáng)度相同，若R構(gòu)型化合物為右旋25°，那么S型化合物為左旋25°。

化學(xué)性質(zhì)方面，除了在手性試劑中表現(xiàn)出的化學(xué)選擇性方面的不同以外，其他的化學(xué)性質(zhì)均相同。

二. 手性分析方法開發(fā)的類型

1 手性衍生方法開發(fā)

手性化合物與手性衍生試劑反應(yīng)，使得一種構(gòu)型與其對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)生物理性質(zhì)的差異，從而可以在反向色譜上根據(jù)分配比的不同實(shí)現(xiàn)手性異構(gòu)體的分離。此種方法隨著手性固定相的開發(fā)，占據(jù)的優(yōu)勢(shì)越來越小。

2 手性色譜柱

手性色譜柱是講手性固定相與色譜填料結(jié)合在一起，通過固定相與化合物之間作用力的差別來實(shí)現(xiàn)對(duì)映異構(gòu)體的分離，現(xiàn)在手性色譜固定相有了越來越多的種類，因此目前大部分的手性分離的方法是用手性色譜柱進(jìn)行分離。

3 手性試劑流動(dòng)相添加法

將手性試劑加入到流動(dòng)相中，在洗脫過程中，手性試劑與對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合，形成非對(duì)映異構(gòu)體，從而實(shí)現(xiàn)在固定相中保留時(shí)間的差異，達(dá)到分離的目的。

三. 手性色譜柱分類

目前市場(chǎng)上所售的手性色譜柱的類型有哪幾類，根據(jù)固定相的不同，我在這里做一個(gè)簡(jiǎn)單的概括：

1）多糖類衍生物固定相色譜柱：此類化合物的固定相為纖維素衍生物和直鏈淀粉衍生物，適用于含有酰胺基、芳香環(huán)取代基、羰基硝基、磺酰基、氰基、羥基、氨基，以及氨基衍生物等的化合物。

1）冠醚類手性色譜柱：固定相為冠醚類手性固定相，主要分離氨基酸及手性中心有胺基的化合物。

2）蛋白質(zhì)類手性色譜柱：固定相為特定酶類蛋白質(zhì)，主要分離苯環(huán)結(jié)構(gòu)的伯胺和仲胺的化合物，用于反相色譜。

3）環(huán)糊精類色譜柱：目前日本YMC公司主要是α、β、γ三種類型環(huán)糊精衍生物的色譜柱。

4）其他色譜柱：離子交換色譜柱，配基交換色譜柱，同樣用于氨基酸及其衍生物的對(duì)映異構(gòu)體的分離。

上述的色譜柱的應(yīng)用范圍最廣的當(dāng)屬多糖類衍生物的色譜柱，可以分離的手性化合物占有80%以上，其于針對(duì)不能用多糖類衍生物分離的化合物，或者用多糖類衍生物色譜柱分離效果不好的化合物。

四. 手性分離原理

市場(chǎng)上這么多類的手性色譜柱，是什么原理，基于什么作用力將對(duì)映異構(gòu)體如此雙胞胎的化合物得到了完美的分離，答案是色譜柱對(duì)于所分離的化合物具有良好的空間選擇性和空間作用力，手性色譜柱的分離原理是將具有光學(xué)活性的單體固定在硅膠或其他聚合物上制成手性固定相，通過引入手性環(huán)境使的對(duì)映異構(gòu)體呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體拆分的目的，而要實(shí)現(xiàn)這種手性分離，我們的化合物和手性固定相之間至少需要存在三種相互作用力，這三種相互作用力包括氫鍵作用，偶極-偶極作用，Π-Π作用，靜電作用，疏水作用，或者空間包埋，這些相互作用力會(huì)影響包分離的結(jié)果，就這些作用力進(jìn)行簡(jiǎn)單的介紹。

1）包含作用（空間包埋）：不論是哪類的固定相，都存在一定的空間構(gòu)型，而固定相的空間結(jié)構(gòu)可形成選擇性腔體，被分離的化合物尤其是苯環(huán)等環(huán)形化合物由于空間結(jié)構(gòu)可被包含于腔體內(nèi)，形成包埋復(fù)合物，從而增強(qiáng)固定相和化合物之間的作用力，而異構(gòu)體由于空間構(gòu)型的不同，作用力的強(qiáng)弱之差形成對(duì)映異構(gòu)體的分離。

2）氫鍵作用：O-H和N-H之間，及F-H 之間的作用力稱為氫鍵作用力，氫鍵作用力是分子間較強(qiáng)的作用力，主要存在于衍生配體與化合物之間，所以，若是被分離的化合物的結(jié)構(gòu)中含有羰基，羥基，酯，酰胺，胺類等官能團(tuán)時(shí)，氫鍵就起到不可缺少的作用。

3）Π-Π相互作用：苯環(huán)的結(jié)構(gòu)之所以這么穩(wěn)定主要的作用的形成了大Π鍵，每個(gè)碳原子最外層的電子緊密的結(jié)合在一起形成電子云使得結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，Π-Π作用是基于苯環(huán)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)之上，若是苯環(huán)上一個(gè)H 被甲基取代，形成Π堿，另一個(gè)苯環(huán)上的H 被硝基取代，形成Π酸，那么這兩者之間形成了酸堿之間的Π-Π堆疊的強(qiáng)大作用力，構(gòu)成異構(gòu)體分離的差異。

4）疏水作用力：此作用力，主要用于蛋白質(zhì)類色譜柱的手性分離中，疏水作用力主要存在于非極性基團(tuán)和水之間，通常在反相中進(jìn)行對(duì)映異構(gòu)體的分離。

5）偶極-偶極作用力：偶極-偶極相互作用是極性分子間最普遍的一種相互作用，即一個(gè)極性分子帶有部分正電荷的一端與另一分子帶有部分負(fù)電荷的一端之間的吸引作用。

用于手性分離的色譜柱和化合物之間主要是這幾種作用力，根據(jù)化合物的所連接的基團(tuán)的不同，形成的作用力的大小，種類也不相同，所以對(duì)于不同類型的化合物進(jìn)行手性分離時(shí)，首先選用適合的色譜柱。

五. 手性方法分離優(yōu)化

而針對(duì)藥物研發(fā)中小分子化合物的手性分離，既不是氨基酸，也不是蛋白質(zhì)大分子，最多采用的色譜柱為多糖衍生類色譜柱，此類手性柱應(yīng)用廣泛，可分離的化合物的種類多，因此就這一類的色譜方法開發(fā)的幾個(gè)重要的因素進(jìn)行表述：

第一，色譜柱的選擇

多糖衍生類色譜柱固定相主要分為：纖維素衍生物和直鏈淀粉衍生物，就其空間結(jié)構(gòu)來講，兩者均是形成螺旋型腔體，使得空間結(jié)構(gòu)對(duì)于化合物有包含作用力，但是直鏈淀粉的空間結(jié)構(gòu)比纖維素的空間結(jié)構(gòu)要大一些，因此作用力稍強(qiáng)一些，因此在選擇色譜柱的基礎(chǔ)上，會(huì)首先建議選用直鏈淀粉類色譜柱；再者，目前手性色譜柱做的比較好的公司，日本大賽路，此公司的多糖類衍生物的色譜柱又分為了鍵合型和涂敷型兩種，就色譜柱的使用壽命和耐用性方面，首選鍵合固定相，鍵合類色譜柱不容易發(fā)生柱流失，而且對(duì)于流動(dòng)相體系的可選用范圍有很大的空間。

第二，流動(dòng)相體系的選擇

流動(dòng)相的體系的選用是與固定相之間形成一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，使得在流動(dòng)相的洗脫下對(duì)映異構(gòu)體得到分離；選定色譜柱以后，那么可選用的溶劑的種類有了一個(gè)范圍，在色譜柱溶劑使用的范圍內(nèi)進(jìn)行流動(dòng)相體系的依次篩選，在篩選的初步，首先使用常規(guī)流動(dòng)相，例如正己烷，正庚烷，異丙醇，乙醇等的流動(dòng)相，再者，選用非常規(guī)的流動(dòng)體系，二氯甲烷，乙酸乙酯等；再選定了流動(dòng)相以后，再進(jìn)行等度比例得篩選，在正向色譜中由于基線漂移問題，首先選用等度洗脫，再依次調(diào)節(jié)適合的流動(dòng)相比例，正相中一般不采用梯度，梯度洗脫基線變化非常大，容易出現(xiàn)不明峰。

第三，色譜參數(shù)的調(diào)節(jié)

1）流速的調(diào)節(jié)上，通常色譜柱會(huì)提供一個(gè)建議流速，例如1ml/min，但有時(shí)在此條件下分離度不夠，那么可以降低流速使得分離度合格；

2）柱溫的調(diào)節(jié)，通常條件下，低溫有利于分離，因?yàn)榈蜏叵聜髻|(zhì)阻力減弱，流動(dòng)相的粘度增大，更有利于異構(gòu)體分離，但是也有例外情況，有的化合物對(duì)溫度敏感的，柱溫對(duì)分離的影響大些，反之，小些，

3）波長(zhǎng)的選定，手性方法開發(fā)中，波長(zhǎng)的選用相對(duì)有關(guān)物質(zhì)開發(fā)來說較為簡(jiǎn)單，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是吸光度相同，且該波長(zhǎng)下吸光度穩(wěn)定，則方法的耐用性良好，滿足這兩個(gè)條件的物質(zhì)的會(huì)選用化合物最大吸收波長(zhǎng)，但是若是方法中使用了添加劑，那么波長(zhǎng)的選用應(yīng)大于添加劑的截止波長(zhǎng)，避免基線影響檢測(cè)。

4）濃度選定：根據(jù)選定波長(zhǎng)下的異構(gòu)體的峰高和峰寬情況，確定檢測(cè)的靈敏度，進(jìn)而確定測(cè)定濃度。

色譜參數(shù)的調(diào)節(jié)需要我們的研發(fā)工作者針對(duì)不同化合物進(jìn)行獨(dú)立探討和實(shí)驗(yàn)，最后確定最終的參數(shù)。

六.手性方法開發(fā)小建議

1，避免固定思維

對(duì)于剛開始入門的所有的分析人員來說，可能希望找到一種模式，來使得針對(duì)所有的化合物有效，比如，低溫一定有助于分離，異丙醇一定比乙醇的體系分離度好，此類等等，但是凡是均有例外，所以需要嘗試摸索不能蓋棺定論，應(yīng)具體化合物具體分析。

2，添加劑

酸性添加劑和堿性添加劑，加入添加劑的目的有兩個(gè)：第一，有效改善峰形，色譜的硅膠填料性質(zhì)決定了加入堿性添加劑，可以起到掃尾的作用；第二：PH 的作用，可以改善樣品在溶劑中官能團(tuán)的解離。

那么如何選擇酸堿添加劑：1，堿性化合物首選堿性添加劑，例如三乙胺 、二乙胺等，添加堿性添加劑可以有效地防止化合物和硅羥基之間的相互作用而引起的拖尾現(xiàn)象；2，酸性化合物首選酸性添加劑：例如三氟乙酸，醋酸等，多糖衍生類固定相的極性較大，酸性化合物有可能與固定相結(jié)合，從而導(dǎo)致色譜峰洗脫不出來，或者峰形嚴(yán)重拖尾，加入酸性試劑可以有效的抑制化合物的解離，實(shí)現(xiàn)化合物的分離。

但是色譜柱都有PH的耐受上限，因此每一款不同的色譜柱的適用說明說上都有最高的添加量，比如大賽路的色譜柱DEA 最高0.5% 三氟乙酸 0.5%最高，若是適用使超過上限會(huì)對(duì)色譜柱的壽命有很大影響。

3，流動(dòng)相選擇

因多糖類衍生物可以在水中和鹵代烷烴中溶解，手性方法中避免使用這一類的溶劑，特殊處理工藝的色譜柱除外，所以常規(guī)條件的流動(dòng)相多選用烷烴，和醇類，在正相色譜中，固定相為極性較大的化合物，那么醇類在洗脫劑中為強(qiáng)洗脫性溶劑，而烷烴類為弱洗脫性溶劑，首選正己烷和乙醇進(jìn)行方法開發(fā)，這一組體系不能將化合物進(jìn)行分離，將乙醇更改為異丙醇或者正丙醇，或者將正己烷改為正庚烷，可能會(huì)有很大的改善，也可能效果不明顯，每一種化合物和溶劑之間的相互作用需要不斷的嘗試。

4，矛盾解決

在整體的研發(fā)中，可能會(huì)遇到相互矛盾的情況出現(xiàn)，例如，異構(gòu)體的分離度不夠，流動(dòng)相中增高烷烴的比例，分離度合格了，該濃度下的靈敏度的信噪比太小，靈敏度和分離度之間形成了矛盾，此時(shí)嘗試柱溫的改變和流動(dòng)體系的改變來滿足我們分離的要求。

在我們的實(shí)驗(yàn)室若是不能提供很多的色譜柱的情況下，而項(xiàng)目時(shí)間緊張的情況下，送到特定的手性公司，例如大賽路，日本YMC進(jìn)行方法摸索可以省時(shí)省力，也不失為一個(gè)便捷的方法，手性方法開發(fā)中的小知識(shí)就先分享這些，主要是一些基礎(chǔ)的原理和方法開發(fā)一些小知識(shí)，歡迎大家一起來探討學(xué)習(xí)。