前 言

中國藥典2015年版四部9101《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》中對專屬性概念的規定為：“專屬性系指在其他成分(如雜質、降解產物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力。”由于被測物千差萬別，方法驗證時的專屬性要求各有不同，專屬性驗證的異常情況也是五花八門，因此下文中分類說明各種不同類型的驗證專屬性異常情況。

有關物質

有關物質對于專屬性要求主要主要體現在三個方面：

● 已檢出與需要檢出的各組分峰之間的分離度應符合要求；

● 主峰應不包含其他組分，即主峰應是單一主成分的峰；

● 如果需要進行強制降解試驗評估降解雜質的檢出情況，降解產物的分離度應符合要求，所有降解產物應能被準確檢出。上述三個要求在驗證中的數據體現為分離度、主峰峰純度與降解試驗的質量平衡結果。

由上文可知，有關物質方法驗證過程中專屬性驗證可能出現的異常情況應該表現在分離度、主峰峰純度與質量平衡驗算三個方面；

（1）分離度不符合要求

如果分離度不符合要求為正常情況，應當進行方法的優化。本文僅論述方法驗證期間分離度不符合要求的異常情況，導致分離度不符合要求的來源主要有色譜柱、儀器、污染等。

即使品牌、型號、規格批號均相同的色譜柱，由于壽命、經歷等的差異，其選擇性也可能存在差異，這種差異可能導致方法驗證期間選用的色譜柱產生的分離度數據異常。為避免該情況的發生，一般來說方法開發期間應當選擇較新的色譜柱，用于方法驗證的色譜柱應當具有較為簡單的“人生經歷”，如未使用過含有表面活性劑的流動相、未分析過組分非常復雜的樣品等，最好為專用柱，并在驗證之前預先評估色譜柱的性能。

不同儀器可能得出不同的組分分離結果，尤其是常見的高壓二元梯度與低壓四元梯度之間，二者經常出現分離度有明顯差異的情況。為避免流動相混合機制的不同導致的分離情況的差異，應當在方法開發期間進行相應的對比研究。如在方法驗證期間發現該情況，應使用與方法開發期間同樣的HPLC進行方法驗證。

污染導致的分離度不符合要求，也非技術原因，本文不做論述。

（2）主峰峰純度不符合要求

導致主峰峰純度不符合要求的情況主要來源以下幾個方面：主成分響應過載、較強的流動相本底吸收、不適宜的參數設置與噪音。

較為常見導致主峰峰純度超過規定的原因一般為主成分響應過載，尤其是自身對照法計算雜質含量的情況，供試品溶液濃度高，主峰響應非常強，甚至是峰頂表現出平頭峰的形式。在這種情況下峰純度數據一般都不會符合規定，可以通過降低進樣量或供試品溶液濃度的方式進行峰純度驗證（不改變方法規定的參數）。為避免這種情況的發生，應當在進行峰純度驗證的同時，對主成分峰在規定的波長范圍內的響應情況進行評估，均不得有過載的現象。

較強的流動相本底吸收，會導致低波長下的響應數據不符合主成分真實值，造成峰純度不符合要求，一般情況下，在方法開發期間應當對此進行評估與優化，避免流動相對檢測的干擾。在方法驗證時發生存在該情況，應當優化峰純度的參數，如將波長范圍的最小波長適當增大。

如果不適宜的積分參數產生不適宜的峰起止時間，也可能造成峰純度不符合要求，可通過優化積分參數的方式解決該問題。

噪音水平也會對峰純度的計算產生影響，方法驗證時應當評估噪音水平，必要時更換噪音水平較好的儀器，或進行其他優化如使用鬼峰捕集柱等。

（3）降解試驗的質量平衡驗算不符合要求

如果專屬性驗證進行了降解試驗的研究，應當評估主成分的減少量與雜質的增加量二者之間的平衡，以確認所有可能的降解雜質均能被準確檢出。導致質量平衡驗算不符合要求的原因主要有以下三個：特定降解雜質未被檢出、二次降解、降解雜質含量不能準確計算與不適宜的降解量。

如果因特定降解雜質未被檢出，導致質量平衡驗算不符合要求，應當對該特定雜質進行評估，如該雜質在樣品生產與貯存過程不可能產生，則可進行相應的說明，并優化降解條件避免該雜質產生；如該雜質在樣品生產與貯存過程可能存在，則應當對檢測方法進行優化。

降解試驗條件不宜過于劇烈，導致降解雜質的二次降解，增加了質量平衡驗算不符合要求的風險。二次降解產物一般在樣品生產與貯存過程不可能產生。為避免該情況的發生，應當在對樣品的化學性質有了充分了解的前提下，進行預先的降解試驗研究，確定驗證時的降解試驗條件。

如果主要降解雜質為未知雜質，其真實響應與主成分存在較大差異，那么就會導致計算出的該雜質含量與真實值相差較大，導致質量平衡驗算不符合要求。為避免這種情況，應當在更早的時期對降解雜質進行詳細的研究，獲得降解雜質的對照品。

質量平衡驗算的方法可以為主成分含量的減少值與雜質的增加值的比值，應在90%-110%的范圍內，主成分含量的減少值一般應使用經過驗證的含量測定方法進行確定，建議主成分的減少量在10%-20%之間；不宜過少使計算結果誤差較大，也不宜過大增加二次降解的風險。

殘留溶劑

殘留溶劑的研究在某種意義上與有關物質類似，是對供試品中可能存在的溶劑進行系統的研究，包括已知的溶劑與未知的溶劑。在目前的專屬性驗證中，大多只是研究色譜圖中已知溶劑峰之間的分離情況，忽略了未知溶劑的研究。由于現在采用的氣相色譜柱大多為毛細管柱，具有非常高的柱效，一般情況下方法驗證時溶劑峰之間的分離度不符合要求的情況較少（方法開發如何優化分離度不在本文論述范圍），因此本文著重論述殘留溶劑方法驗證時出現的未知溶劑峰。

未知溶劑峰的來源一般主要從兩個方面：樣品本身與污染。

（1）樣品本身引入的未知溶劑峰

樣品本身引入的未知溶劑峰在方法驗證期間需要進行細致的研究，說明其來源，必要時確認結構與性質，制定合理的限度；如不對該溶劑進行檢測，應當具有合理的理由。

樣品本身引入的溶劑峰來源一般有以下幾個來源：副反應產物、降解產物與熱降解產物。

API在合成過程中可能產生一些副反應產物為有機溶劑殘留在供試品中，如酰氯遇醇的酯化物或某些基團脫落的小分子產物等，為避免方法驗證時該類溶劑的干擾，應當在方法開發期間對這種可能的副反應產物溶劑進行系統的評估。方法驗證期間，可通過GCMS確認其結構式，如為預期的副反應產物，且含量較高，應當訂入質量標準，制定合理的限度。

某些降解產物可能為有機溶劑，應當訂入質量標準，制定合理的限度。

如果供試品遇熱不穩定，進行殘留溶劑檢測時的未知溶劑峰為熱降解產物，則可通過相關實驗與理論說明該未知溶劑峰為熱降解產物，無需訂入質量標準。必要時優化檢測條件，避免熱降解產物的產生。

（2）污染

污染產生的未知溶劑主要有兩大來源生產過程與檢測過程。生產過程可能引入未知溶劑常見于不同產品在同一干燥設備中干燥的交叉污染，檢測過程引入的未知溶劑常見于供試品溶液與其他有機溶劑位置較近通過空氣傳播導致的污染等。由于這些情況并非技術原因，且有無數種可能性，通過相關管理制度可避免，本文不再詳細論述。