編者按

 

3D生物打印技術是一種基于傳統3D打印技術發展起來的新興技術，可以把生物相容性材料、細胞或生物活性因子進行精準組裝，為組織工程研究提供新方向。在眾多3D生物打印技術中，光固化3D生物打印技術在組織工程研究領域發揮著重要作用，該技術的成功應用與生物材料的光固化特性不可分割。在可見光固化材料中，光交聯水凝膠因聚合速度快等優勢，極具研究價值和應用潛能；可見光在生物安全性方面具有獨特的優勢，因此，將可見光交聯技術應用在3D生物打印領域極具應用前景。

 

中國工程院院刊《Engineering》2021年第7期刊發中國科學院深圳先進技術研究院賴毓霄教授科研團隊的《可見光引發的3D生物打印技術及其生物墨水材料在組織工程領域的研究進展》一文。文章綜述了可見光固化3D生物打印方法及可見光引發的光聚合水凝膠的研究現狀，總結了引發劑的類型及其活化機理，并研究了從自由基聚合到硫醇-烯烴“點擊”反應的直接和間接光誘導反應。文章最后對可見光引發的3D生物打印設備及水凝膠目前在生物醫學領域應用中存在的挑戰和前景進行了探討。

 

 

一、引言

 

隨著人體重要器官終末期衰竭率的激增，醫學界迫切需要一種能夠有效修復和恢復受損器官的創新治療方法。此外，器官移植領域面臨的挑戰在于最佳捐贈者器官短缺和匹配的困難。近年來組織工程在再生受損組織方面取得了顯著成就并引起了臨床移植醫生和研究人員的廣泛關注。組織工程被認為是一種可能的手段，用于解決臨床對活體器官日益增長的需求以及解決活體器官移植的局限性。細胞、支架和生物/ 生化因子一般被稱為基于組織工程的再生醫學策略的“構建模塊”的基本要素。理想的組織工程生物活性支架將為細胞、生物活性因子和周圍組織之間的相互作用提供平臺。此外，支架為細胞提供物理支撐并控制因子的釋放。

 

Charles W. Hull于1986年首次提出三維（3D）打印技術。3D打印是一種由計算機輔助設計模型來構建物體的制造過程。與傳統制造（如鑄造和鍛造工藝）相比，3D打印是指通過逐層增加材料的方式將數字模型制造成3D實體物件或支架的過程，屬于增材制造技術的一種。生物打印技術可通過設計有利于細胞生長的支架微觀結構以及調節生物活性因子的分布滿足組織再生需求，使其變得越來越有吸引力。打印材料、細胞和打印設備/方法是3D生物打印技術中最重要的三個因素。

 

根據美國材料與試驗協會標準（F2792），3D打印技術分為光聚合成型、材料噴射成型、材料擠出成型、粉末床融化、黏結劑噴射、層壓和直接能量沉積等8種打印技術。在細胞活力和可打印性方面，基于光聚合的打印方法相較于其他類型的生物打印方法具有許多優勢，如室溫下能夠快速固化、高保真打印以及溫和的反應過程。通過調節光強、曝光時間和照射面積，該打印方法可以方便地控制打印結構和速度。在各種生物打印方法中，有4種方法被廣泛應用于光固化生物打印：噴墨打印、擠出式打印、立體光刻印刷和數字光固化。

 

生物墨水是生物打印中的打印前體，通常是基于包含細胞的熱敏或光聚合材料。它作為細胞載體，能夠確保打印成型中的精確定位、避免打印過程中細胞機械損傷和保護打印后材料形成的有利于細胞生長的微環境。在眾多的打印材料中，水凝膠是一類通過化學鍵或物理力形成的3D網絡聚合物。它可以在水中膨脹，但不會溶于水。一些水凝膠顯示出類似于天然細胞外基質（ECM）的可滲透結構。這種結構為細胞增殖提供了優越的3D微環境。鑒于這些特性，許多類型的水凝膠都可以應用在組織工程的各個領域。聚合物鏈之間會發生兩種交聯：化學交聯和物理交聯。不同的交聯方法對水凝膠的凝膠動力學以及性質會產生不同的影響。物理交聯的水凝膠主要依靠分子間作用力、氫鍵和其他弱相互作用力。化學交聯的水凝膠則由共價鍵形成，相比物理交聯的水凝膠強度更高。在化學交聯方法中，光聚合因其獨特的性能而備受關注。

 

光聚合是獲得共價交聯水凝膠的一種簡單、干凈且方便的方法。光聚合可以在空間和時間上有效地控制水凝膠的形成和結構。目前，光聚合主要是用紫外線（UV）來實現的，但細胞在暴露期間可能會受損。相比之下，當將紫外線換成可見光時，水凝膠體系則擁有更高的細胞相容性和更廣泛的應用前景。此外，可見光具有更高的穿透深度，這使得水凝膠的結構更均勻。可見光交聯水凝膠已在組織工程、3D 細胞封裝和藥物輸送等眾多領域得到廣泛的研究和應用。

 

在本文中，我們簡要討論了可應用于可見光誘導生物打印的3D生物打印技術及設備的操作原理和特點（表 1）。然后，系統概述了可見光交聯生物墨水，包括交聯機制和可見光引發劑，并重點介紹了它們在生物醫學中的應用。最后，討論了生物打印和可見光交聯水凝膠所面臨的挑戰，并且對發展前景與發展方向進行了展望。

 

表1 可見光誘導的生物打印方法 

 

 

SLA: stereolithography; DLP: digital light processing.

 

二、光誘導 3D 生物打印法

 

（一）基于噴墨技術的生物打印

 

噴墨打印源于商業的2D噴墨打印技術，該技術將載有細胞的生物墨水滴落并沉積到預定區域，形成預設的形狀。從噴嘴噴射到基板上的液滴通常是由熱驅動或壓電驅動產生的，如圖1所示。熱驅動通過加熱元件產生液滴，在2 μs內使生物墨水過熱，因此高溫（如300 ℃）不會影響細胞活力。壓電驅動可快速調節電壓，迫使生物墨水通過壓電材料排出液滴。生物墨水的物理和化學凝膠過程可以與打印過程同時發生，以保證印刷保真度。由于液滴體積小（直徑為10~50 μm）且噴射速度很快（每分鐘高達10 000個液滴），所以基于噴墨技術的打印可確保高打印分辨率（低于50 μm）和較快的打印速度。此外，打印后的細胞活力可以超過80%。然而，基于噴墨技術的生物打印的一個缺點是該技術僅限于使用低黏度生物墨水，因為高黏度生物墨水往往會堵塞噴嘴，導致高剪切應力。因此，基于噴墨技術的生物打印在生物墨水的材料和細胞濃度的選擇方面有限制。此外，構造大而復雜的3D結構也是一項挑戰。Acosta-Vélez等開發了一種藥物片劑，該藥物可以在30 s內在可見光下通過噴墨打印制造出來。使用可見光系統而沒有使用紫外線，是因為后者會影響藥物的穩定性。

 

 

圖1 噴墨生物打印示意圖。

 

（二）基于擠壓技術的生物打印

 

基于擠壓技術的打印是用于制造支架的最常見的增材制造方法之一。擠壓由氣動、活塞驅動和螺桿驅動系統控制。與基于噴墨打印的情況不同，擠壓過程的壓力更方便控制，因而生物墨水的黏度可選范圍更廣（30 ~ 6 × 107 MPa·s）。也就是說，盡管在活細胞支持方面受到限制，但該技術可選的材料更加多樣化。根據擠壓過程的基本理論，基于擠壓技術的打印方法主要的缺點是針頭大小導致的分辨率低和打印速度慢。當前生物打印應用的擠壓式打印技術的分辨率可以達到100 μm。當將光交聯生物墨水應用于基于擠壓的生物打印時，光學設備位置的設置至關重要。光固化過程可以在擠壓之前（預交聯）、之后（后交聯）或過程中（原位交聯時）進行，如圖2所示。Ouyang等的研究表明，預交聯會導致擠壓力過高且不一致、結構不均一和細胞活力低（約47%）。盡管后交聯可以提高細胞活力且降低擠壓力，但生物墨水在穩定之前就流動了，因此無法保持細絲結構。當用透光毛細管替換針頭時，水凝膠可以在沉積之前交聯（用紫外線或可見光進行原位交聯），從而使打印更具高保真度且有相對較高的細胞活力（超過95%）。通過調整水凝膠濃度，在基于擠壓的生物打印中，后交聯在可見光下能夠實現比在紫外線下更高的保真度，并確保高細胞活力（超過90%）。

 

 

圖2 三種擠出式生物打印示意圖。

 

（三）立體光刻印刷技術和數字光固化

 

立體光刻印刷（SLA）與數字光固化（DLP）具有相似的成型機制。

 

SLA是使用數字微鏡陣列來控制打印區域每個像素光強度的打印方法之一。在SLA打印過程中，激光以點對點的方式投射到液體感光材料上以形成固化層。在第一層固化后，平臺會上升一定高度，之后對第二層進行光交聯。重復此操作，直到打印出完整的形狀[圖3 （a）]。SLA不需要通過噴嘴擠出，并且比基于擠壓的打印更快、更準確且具有更高的分辨率（< 100 μm）。一般來說，SLA生物打印使用紫外線作為光源。由于紫外線在生物打印過程中會使細胞受損，因此該方法具有一定的局限性。Wang等開發了一種可見光誘導的基于SLA的生物打印法，并將其與基于曙紅Y（EY）的光引發劑一起使用，以制造聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和甲基丙烯酸明膠（GelMA）的復合水凝膠。該方法所達到的分辨率為50 μm，細胞能夠存活至少5 d，且細胞活力達85%。

 

DLP生物打印類似于基于SLA的打印法，不同之處在于它通過投影儀來固化層圖像而不是以點的形式將光投射到光聚合材料上[圖3（b）]。DLP的打印速度高于SLA，尤其是在打印較大的物體時更為明顯。然而，受限于數字光鏡的投影面積和分辨率，與SLA相比，DLP的可打印區域變少了。因此，DLP 方法通常只用于打印小的物體。Lim等探索了絲素蛋白（SF）水凝膠的3D DLP打印分辨率。他們在 X方向獲得了66 μm的分辨率，在Z方向獲得了146 μm的分辨率。這表明該方法能夠高精度地打印復雜結構（如埃菲爾鐵塔）。Lim等開發了一種可見光誘導的DLP系統。該系統實現了50 μm的分辨率和超過90%的細胞活力。DLP是一種高效的逐層打印法。Kelly等基于DLP方法提出了更新一代的制造方法，通過將光敏聚合物預聚液在動態演化的光場中旋轉來進行光聚合而生成打印結構[圖3（c）]。這種方法可以允許打印更大體積的物體，并且比普通的DLP 方法打印速度快幾個數量級。Bernal等使用可見光（405 nm）介導的體積式生物3D打印技術[圖3 （d）]打印厘米級的復雜結構（如有血管嵌入的復雜骨小梁結構和復雜的半月板結構），且其中包覆的細胞存活率很高（> 85%），打印的整體時間只需要幾秒到幾十秒。這些方法見表1。

 

 

圖3 SLA（a）和DLP（b）生物打印方法示意圖。經Elsevier許可，轉載自參考文獻，©2012。（c）轉軸式立體光刻打印示意圖。經Science許可，轉載自參考文獻，©2019。（d）轉軸式生物3D打印物料平臺。經Wiley許可轉載自參考文獻，©2019

 

三、可見光交聯材料

 

（一）可見光引發劑

 

大多數可見光交聯的生物墨水都需要光引發劑來引發。光引發劑的類型和暴露于可見光中的持續時間會影響細胞活力和光引發效率。因此，選擇可見光引發劑時需要考慮吸收光譜、水溶性、產生自由基的能力和穩定性。

 

根據聚合的活性物質，可見光引發劑可分為自由基光引發劑和陽離子光引發劑兩種。然而，陽離子光引發劑在聚合開始時會產生質子酸，因此不能應用于生物醫學領域。由此可知，可見光交聯水凝膠主要依賴于可見光引發的自由基聚合。自由基光引發劑可分為I 型光引發劑（單組分熱解）和II型光引發劑（光敏劑/ 共引發光引發劑）。I型光引發劑吸收入射光子，并在光作用下可以裂解為兩個自由基。然而，在可見光區域內可選的I型光引發劑較少，通常使用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸鋰（LAP）作為光引發劑。相比之下，II型光引發劑有更加多樣化的替代品，它們從共引發劑中提取氫以生成二級自由基。目前，釕吡啶絡合物、EY和樟腦醌（CQ）引起了學者的關注并被廣泛應用于組織工程。在可見光交聯水凝膠系統中，引發劑的細胞毒性和吸收光譜對于封裝細胞尤為重要。常用的可見光引發劑見表2。

 

表2 可見光引發劑的類型 

 

 

FR: fluorescein; RF: riboflavin; HA-Tyr: hyaluronic acid-tyramine; MeHA: methacrylated hyaluronic acid; MeGC: methacrylated glycol chitosan; Gtn-HPA: gelatin-hydroxyphenylpropionic acid; hMSC: human marrow stromal cell. [Ru(II)(bpy)3]2+: tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate.

 

CyQuant細胞增殖直接檢測法（CyQuant direct cell proliferation assay method）表明，隨著LAP濃度的增加，人原發性腎小管上皮細胞（hRPTEC）的存活率雖然略有下降，但仍然能滿足生物相容性的標準。Lin 等在早期工作中開發了一種由LAP光引發劑引發的 GelMA水凝膠，并在其中搭載了人骨髓間充質干細胞（MSC），在凝膠中該干細胞具有長期的細胞活力、增殖能力超過90 d，并且細胞形態良好。雖然LAP可以通過吸收近紫外線藍光（405 nm）的能量而產生自由基，但是用這種產生近紫外線藍光元件使得生物打印設備的成本很高，因此這種類型的設備在成本上并沒有明顯優于目前的紫外生物打印系統。這種強烈的近紫外線藍光對哺乳動物細胞有害并會破壞細胞生命活動的進程。CQ、熒光素和核黃素（RF）具有相似的吸收光譜（在 400 nm和500 nm之間）。利用甲基丙烯酸乙二醇殼聚糖（MeGC）水凝膠對這幾種引發劑進行細胞毒性測試，實驗結果表明，RF引發的殼聚糖水凝膠機械強度最高、細胞毒性最低。此外，膠凝時間和細胞呈負相關。Donnelly等開發了一種RF引發的酪胺取代透明質酸（HA-Tyr）水凝膠，并將其覆蓋在TC-28a2軟骨細胞上，一天后，超過99%的細胞仍然存活。

 

在可見光引發劑中，EY比其他的引發劑具有更多的優勢。EY是高度水溶性的，在大約515 nm處有一個吸收峰，并且細胞毒性很低。EY和LAP對肝祖細胞HepaRG表現出相似的細胞相容性。值得注意的是，與LAP相比，在由EY引發的明膠水凝膠中，肝臟相關基因的表達程度相對更好。Gwon等研究證明，人脂肪間充質干細胞在肝素修飾的透明質酸（HA）水凝膠中能夠有效生長和增殖（細胞活力為95%）。此外，水凝膠可以支持脂肪來源的間充質干細胞的3D結構舒展以及成脂分化。Kerscher等證明，EY可以在 1 min內引發低密度的GelMA水凝膠聚合成膠，并能夠促進高效的心肌細胞分化。在分化的第8天，水凝膠會自發性收縮，同時相關基因的表達、凝膠收縮的同步性、頻率、速度都隨時間而變化。

 

釕吡啶絡合物[Ru(II)(bpy)3]2+/硫酸鈉（SPS）系統也顯示出獨特的優勢。[Ru(II)(bpy)3]2+/SPS可緩減聚合過程中氧的抑制作用，從而提高3D生物打印時垂直方向的保真度。3D生物打印雖然廣泛用于打印復雜結構的水凝膠，但在打印過程中維持垂直方向上的結構和保持水平方向上的精度仍具有挑戰性。一些研究表明，氧氣抑制效應直接影響3D生物打印的光固化打印保真度和水凝膠結構。由于氧氣會影響自由基的存在，自由基會與氧氣發生反應，并轉化為過氧化氫自由基，而過氧化氫自由基不能與不飽和鍵發生反應。同時，過氧化氫自由基會減少系統中質子的數量，形成氫過氧化物或醇類，使共價交聯的形成受阻。這些反應會導致水凝膠的成型結構不充分，從而影響層與層之間的堆疊和垂直方向的印刷保真度。為了解決這個問題，Lim等應用了[Ru(II)(bpy)3] 2+/SPS引發的可見光3D打印，與I2959 引發的紫外線3D打印相比較，前者減輕了氧氣抑制多孔生物膜構建的影響（圖4），并在21天內可以保持85%的細胞存活率。Al-Abboodi等開發出一種由 [Ru(II)(bpy)3]2+/SPS引發的明膠-羥基苯丙酸（Gtn-HPA）結合水凝膠，該水凝膠也顯示出了良好的細胞存活率（超過85%）。

 

 

圖4 紫外線和可見光聚合的GelMA/膠原蛋白（Col）打印支架的結構差異。Vis：可見光；Ru：[Ru(II)(bpy)3] 2+。經American Chemical Society許可，轉載自參考文獻，©2016

 

（二）光聚合機制和凝膠化機制

 

光聚合有兩種類型：無光引發劑聚合和由光敏劑、光引發劑受光激發而引起聚合。無光引發劑聚合由紫外線直接引發聚合。Farkas等開發了一種無光引發劑的3D 支架。它是在波長為248 nm或308 nm的光下通過準分子激光光固化來制造的。該支架相比由光引發劑引發制造的支架具有更高的細胞活力。然而，這種類型的聚合所需的能量高于單體共價鍵的能量。此外，在可見光范圍內滿足這一要求有一定挑戰性。因此，它不太可能應用于可見光誘導的聚合領域。可見光下的聚合需要光引發劑。研究中被廣泛應用的三種凝膠化機制包括自由基鏈式聚合機制、硫醇-烯烴“點擊”反應機制和光催化的自由基偶聯反應機制。凝膠化機制的詳細信息如下所述。

 

1. 自由基鏈式聚合機制

 

合成化學的發展和進步使功能單體和大分子鏈能夠通過各種方法進行改造和合成。此外，可以通過自由基聚合（FRP）的方法來生成光交聯生物墨水。如圖5所示，FRP過程有三個反應階段：鏈引發、鏈增長和鏈終止。將引發劑暴露在光下生成自由基后，自由基會與雙鍵反應形成新的自由基。新的自由基進一步與單體上的雙鍵發生反應或形成低聚物，并進一步進行鏈增長直至鏈終止。

 

由于甲基丙烯酸酯單體的細胞毒性，適用于FRP的生物墨水是通過向天然或合成的大分子鏈中引入少量的甲基丙烯酰基團（使用甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸甘油酯或甲基丙烯酰氯）制成的，之后通過選擇合適的光引發劑來制作水基光交聯生物墨水。自由基聚合機制和凝膠化機制的說明如圖5所示。

 

 

圖5 自由基聚合機制和凝膠化機制。hv：光子能

 

2. 硫醇 - 烯烴“點擊”反應機制

 

硫醇-烯烴“點擊”反應是一種快速、高度選擇性的通用方法，用于制備可光交聯的水凝膠。19世紀中葉，當Charles Goodyear發現天然橡膠（聚順式異戊二烯）的硫化時，標志著經典的硫醇化學出現了。此后，學界對巰基/乙烯基聚合的機理、動力學特征和特性進行了廣泛的研究。巰基/自由基光聚合的自由基增長機制與乙烯基自由基鏈的生長機制不同。此外，巰基單體相當于交聯劑。巰基-烯烴反應不受空氣中氧抑制的影響，可快速實現光聚合。因此，光引發劑的使用量較少。此外，形成的硫醚鍵可以增強材料的強度。

 

引發劑活化后，從巰基中提取質子形成硫基自由基。之后，硫基自由基與乙烯基鍵發生反應。該反應會形成硫醚鍵和碳中心自由基，它們可以生成另一個硫基自由基。巰基-烯烴反應會持續至可反應部分耗盡為止。與富含電子的乙烯基單體（如降冰片烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯或共軛雙烯）的反應涉及乙烯基單體的均聚反應以及巰基和乙烯基之間的共聚反應（圖6）。

 

 

圖6 硫醇-烯烴“點擊”反應機制。hv：光子能

 

3. 光催化的自由基偶聯反應

 

這類反應通常需要含酚羥基化合物的參與，如酪胺。此外，釕[Ru(II)]和EY常被用作該反應的可見光引發劑。不同的光引發劑在反應中有不同的引發機理。[Ru(II)(bpy)3]2+在可見光下被光氧化成[Ru(III)(bpy)3]3+。然后，活化的Ru(III)從酚羥基中吸引一個電子。這就生成了一種可以進攻多種其他基團的自由基，如圖 7（b）所示。然而，基態EY吸收光子后轉變為單重態（1EO），之后通過系統間的交叉轉換為長壽命的三重態（3EO*）。能量在氧氣存在時用于形成單態氧（1O2）。然后，單態氧與酚羥基反應生成維持交聯的自由基，如圖7（c）所示。實現這一反應的常用策略是用含有酚羥基的分子修飾聚合物。Sakai等通過用酪胺修飾海藻酸鹽成功地開發了一種生物墨水。這種墨水在普通臺燈的照射下，10 s內就能完成凝膠化。

 

 

圖7 光催化的自由基偶聯反應的機理。（a）釕的引發機理；（b）EY的引發機理；（c）光催化的自由基偶聯反應機理

 

（三）可見光交聯的材料

 

光聚合材料主要分為天然衍生材料和合成材料。讓材料具有光聚合能力最常見的方法是用含有雙鍵的化合物，如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯、共軛二烯和酪胺修飾特定的側基或端基。常見的光聚合材料類型及改性方法見表3。

 

表3 光聚合材料的特點及應用 

 

（點擊查看大圖）

 

Gelatin-FA: furfurylamine-conjugated gelatin; Gel-NB: gelatin norbornene; Gel-SH: thiolated gelatin; Hpp-GC: chitosan 3-(4-hydroxyphenyl) propionic acid conjugate; MeHA: methacrylated hyaluronic acid; NorHA: norbornene functionalized hyaluronic acid; SFMA: methacrylated SF; Alg-Norb: norbornene functionalized alginate; Alg-Ph: phenolic hydroxyl functionalized alginate; PEG: polyethylene glycol; NorPEG: norbornene-terminated PEG; PVA: polyvinyl alcohol; PVAMA: methacrylated PVA; Ala: alanine; Gly: glycine; Pro: proline; Arg: arginine; Glu: glutamic acid; Hyp: hydroxyproline.

 

1. 天然衍生材料

 

細胞周圍由復雜的結構和多種功能性大分子組成，稱作細胞外基質（ECM）。天然材料來源于有機體中的多糖和蛋白質。明膠、膠原蛋白等天然材料大多具有優越的細胞響應性和細胞黏附性，并可在體內降解。此外，天然材料價格低廉且可再生，但存在降解速率高、凈化工藝復雜、機械性能差等缺點。

 

明膠是一種從動物組織中分離出來的動物蛋白，通過膠原蛋白的熱變性制備而成，其中膠原蛋白是含有18種氨基酸的多肽的多相聚集。考慮到明膠的結構，明膠具有功能單體改性的潛力，并且不會顯著降低其細胞相容性。Lin等介紹了可降解的明膠水凝膠包裹的人骨髓間充質干細胞，它們具有持久的活力、增殖能力（超過90 d）和良好的完整性。2000年，Van Den Bulcke等首先開發了可光聚合的明膠甲基丙烯酰衍生物GelMA，并申請了專利。該衍生物由（羥基）-賴氨酸和鳥氨酸側鏈上的伯胺與甲基丙烯酸酐反應得到。在低溫下（< 25 ℃），GelMA預聚液可以在鏈之間形成氫鍵從而增加溶液的黏度。這有助于達到3D 打印擠出工藝的黏度需求。GelMA作為一種獨立材料或通過與其他材料復合共同交聯形成水凝膠，在生物打印領域得到了廣泛的應用。除了GelMA外，還開發了幾種類似修飾方法的可光交聯明膠衍生物。Mazaki等開發了一種呋喃胺共軛明膠，它可以通過可見光交聯，同時又可以在體外支持骨髓間充質干細胞的軟骨分化進程。

 

殼聚糖是一種多糖，由自然界中廣泛存在的幾丁質（蝦殼、蟹殼等）經過脫乙酰作用得到，化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-β-D-葡萄糖。由于其具有抗菌活性，殼聚糖已被美國食品藥品管理局（FDA）批準用于醫用傷口敷料。就其化學性質而言，氫鍵的存在會降低殼聚糖在水中的溶解度。殼聚糖中豐富的基團，如酰胺基，為修飾局部性質提供了許多機會。殼聚糖可與甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸甘油酯反應，形成可光聚合的殼聚糖衍生物。這種衍生物可用于制備生物活性載體和生物墨水。

 

透明質酸是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺結構單元組成的天然糖胺多糖。透明質酸通常以陰離子形式存在，廣泛分布于結締組織、上皮組織和神經組織。透明質酸的每個單體都有活性基團修飾位點。因此，研究人員對現有合成透明質酸大分子單體衍生物，如甲基丙烯酰透明質酸和降冰片烯功能化透明質酸的化學方法進行了改進。就其在細胞外基質中的作用而言，透明質酸表現出高親水性和細胞相容性，以支持細胞增殖、遷移和分化。Gwon等研究表明來自人脂肪的間充質干細胞在肝素修飾的透明質酸水凝膠中生長和增殖狀況良好。在細胞培養過程中，可以觀察到幾種功能標記的蛋白的分泌和其協同作用。Hinton等利用甲基丙烯酸酯化透明質酸（MeHA）、膠原蛋白等軟材料，測試了一種基于擠壓的新型生物打印方法（懸浮支撐自由打印法），該方法在生物打印天然材料中展現出巨大的應用潛力。

 

絲素蛋白（SF）是一種從蠶絲中提取的不溶性蛋白。SF有三條分子鏈：輕鏈、重鏈和糖蛋白P25。重鏈和輕鏈之間通過二硫鍵連接。此外，它們再與糖蛋白P25通過非共價作用結合。由于其無毒、免疫原性低、降解率低，SF可用于創面敷料、酶固定化基質、血管修復體和結構種植體。經改性后的SF也可應用于生物打印。Kim等開發了一種改性的甲基丙烯酸縮水甘油酯SF生物墨水。它可以構建心臟、血管、腦、氣管、耳朵等高度復雜的器官結構，具有優秀的結構穩定性和可靠的生物相容性。

 

海藻酸鹽是一種陰離子多糖，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按（1→4）鍵連接而成的長鏈聚合物。海藻酸鹽具有優越的生物相容性、低毒性、低成本和方便凝膠化等特性，適用于生物打印。一般來說，海藻酸鹽的生物打印過程涉及二價陽離子（Ca2+等）的添加。然而，普通海藻酸鹽水凝膠在體外培養過程中迅速失去這些機械性能（9天內失去約40%）。此外，它們的細胞黏附位點不足。如果海藻酸單體的羧基與2-氨基乙甲丙烯酸酯（AEMA）反應，得到的甲基丙烯酸酯化的海藻酸鈉進行光交聯并改善其機械性能。降冰片烯功能化海藻酸鹽可在較低濃度（質量分數為2%）下實現打印，并保持比純離子交聯打印更穩定的3D結構。

 

2. 合成材料

 

與天然材料相比，合成材料的生物活性不足，但由于控制了化學和生物官能團，它們的化學和機械性能具有可重復性、穩定性和可調性。

 

聚乙二醇（PEG），又稱聚環氧乙烯或聚氧乙烯，是乙二醇的線型合成聚醚，具有親水性。PEG的末端官能團及其高度可控的分子量使其末端官能團及合成物可以被修飾成四臂或八臂，從而增加了材料的多樣性。PEG應用于組織工程的主要優點包括結構和力學性能可調、生物相容性、親水性、低細胞毒性和非免疫原性。由于PEG是不可降解的，對細胞沒有足夠的黏附位點，通常與其他材料或多肽混合制成生物墨水。Bal等使用幾種多肽來抑制PEG水凝膠（由 EY引發），以此觀察水凝膠中間充質干細胞和受體的結合如何影響胰島中胰島素的分泌。

 

聚乙烯醇（PVA）是一種親水性線性合成乙醇均聚物。大量的側羥基為生物分子提供了附著位點和修飾的可能。由PVA及其衍生物制備的水凝膠，因化學性質可調節而得到了廣泛的應用。純PVA水凝膠無法供細胞長期生長：從第1天到第14天，MSC細胞活力從87%下降到71%。與 GelMA結合后，第14天時細胞活力可達92%。

 

（四）可見光誘導的 3D 生物打印應用

 

1. 組織工程

 

3D生物打印主要用于組織工程和再生醫學。最終目標是制造人造組織替代品，進而構建人造器官。然而，目前還無法形成一種功能完整的人工組織替代品用于體內。因此，為了實現這一目標，主要研究集中在模擬體內條件的體外模型。

 

為了實現體外模型的制造，研究人員需要高打印分辨率來模擬體外組織的復雜結構。Wang等開發了一種基于SLA的可見光誘導生物打印系統，用EY制備 PEGDA和GelMA水凝膠。垂直3D結構的分辨率為50 μm [圖8（a）]，NIH 3T3成纖維細胞活力為85%且保持了至少5 d。Bertlein等的研究表明，可見光 + [Ru(II) (bpy)3] 2+/SPS體系比紫外線 + I2959體系具有更高的保真度[圖8（b）、（c）]和能維持更長時間的（3周）細胞活力。Lim等還開發了一種用于DLP生物打印的載細胞丙烯酸甲酯聚(乙烯醇)（PVAMA）/明膠甲基丙烯酰氯（GelMA）生物墨水。它能夠以高分辨率（25~50 μm）對復雜結構進行生物打印[圖8（d）]。它還能使裝載的細胞在14d內的存活率高達90%。

 

 

圖8（a）可見光誘導立體光刻法制備水凝膠結構。轉載自參考文獻，經IOP Science許可，©2015。（b）GelMA/Col水凝膠打印的具有連通孔的3D 結構。轉載自參考文獻，經American Chemical Society許可，©2016。（c）不同引發劑引發的GelMA/Col水凝膠厚度變化比例。Ru：[Ru(II)(bpy)3] 2+。轉載自參考文獻，經American Chemical Society許可，©2016。（d）螺旋二十四面體，展現打印的復雜程度。*：P < 0.05。轉載自參考文獻，經IOP Science許可，©2019

 

除了高分辨率外，打印結構中細胞增殖、黏附和分化的狀態也很重要。Wang等也開發了EY/GelMA 水凝膠體系，該體系在打印圖案的第5天形成了3D細胞網絡（這揭示了研究細胞生長形態的潛在好處），如圖 9（a）所示。Sakai等的研究表明，人脂肪間充質干細胞在酪氨酸化的透明質酸/明膠打印結構中裝載25 d 后，Nanog、Oct-4和Sox-2基因顯著上調（是第1天的2~3倍）。這表明人脂肪間充質干細胞保持了多能性。Lim等證實PVAMA/GelMA水凝膠支持間充質干細胞成骨和成軟骨分化。Ouyang等報道了將降冰片烯修飾的透明質酸水凝膠用于包覆MSC。經過56 d的軟骨形成培養后，組織學分析證實了被包裹的MSC可以產生糖胺聚糖（GAG）和膠原蛋白。Petta等最近介紹了一種通過酶和可見光交聯的雙交聯透明質酸生物墨水。在擠壓生物打印過程中，它在低取代條件下表現出柔性剪切細化性能，而且它保留了主要結構和性質，使人骨髓間充質干細胞、軟骨細胞、人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）成纖維細胞得以培養，并恢復其3D形態。

 

制備由不同細胞和材料組成的多層結構是模擬皮膚結構的關鍵要求。DLP生物打印可以逐層形成類似于皮膚含有水凝膠的細胞。Kwak等用可見光誘導的 DLP開發了SF/PEG復合水凝膠作為人造皮膚模型。在保持較高的細胞存活率的同時，水凝膠表面在6周時形成致密的角蛋白層，如圖9（b）所示。

 

心臟是人類最重要的器官之一，復雜的結構和多細胞的相互作用決定了心臟的功能。為了研究心肌細胞和成纖維細胞在體內的相互作用，Kumar等使用呋喃明膠和RF打印含有C2C12成肌細胞和STO成纖維細胞的多層薄片。在培養和孵育過程中，不同的細胞水凝膠層在交界處并沒有分開，而是因細胞間的相互作用結合在一起[圖9（c）]。Kumar等也開發了一種纖維蛋白-明膠生物墨水，用于心肌細胞和心臟成纖維細胞的共培養和偶聯。此外，免疫化學數據顯示，兩種類型的細胞之間通過Connexin43黏附連接實現了異細胞偶聯，這對細胞相互作用至關重要。

 

功能齊全的人工器官重建離不開血管化網絡的構建。生物3D打印技術是一種構建血管結構的有效方法。Sakai等使用[Ru(II)(bpy)3] 2+/SPS來聚合經過酪胺化修飾的海藻酸鹽生物墨水，成功打印出一個包含直徑為1 mm的可灌注的光滑螺旋腔的凝膠方塊。這種凝膠方塊也為以后在體外構建包含血管網的復雜3D細胞培養結構打下基礎，如圖9（d）所示。

 

 

 圖9（a）3D生物打印水凝膠中細胞微絲網絡熒光染色圖。轉載自參考文獻，經American Chemical Society許可，©2018。（b）3D打印包載成纖維細胞的SF/PEG水凝膠表明形成的角蛋白層。轉載自參考文獻，經Elsevier許可，©2019。（c）STO成纖維細胞與C2C12成肌細胞共培養界面。MyoD1：肌原性調節蛋白。轉載自參考文獻，經Wiley許可，©2019。（d）3D打印水凝膠中空可灌流的螺旋導管結構（直徑為1 mm）。轉載自參考文獻，經American Chemical Society許可，©2018

 

2. 藥物輸送

 

3D生物打印技術，特別是基于噴墨打印技術，已被應用于藥物輸送治療。3D生物打印技術為傳統片劑制造技術提供了一個可行的替代方案：根據基因組和病理生理學特征定制個性化劑型。此外，利用生物打印技術可以方便地設計片劑的形狀，從而控制藥物的釋放。如由紫外線交聯PEGDA和N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）制成的藥片，通過3D噴墨打印來控制用于治療高血壓和心力衰竭的卡維地洛的釋放。然而，紫外線會影響活性藥物成分的穩定性。可見光誘導噴墨生物打印是一種更有效的方法。Acosta-Vélez 等使用噴墨生物打印技術研發了一種含有親水性羅匹尼羅的可見光交聯降冰片烯修飾透明質酸片劑，用于治療帕金森病和不安腿綜合征。在酸性條件下，羅匹尼羅在15 min內釋放60%，適用于口服藥物。Acosta-Vélez等開發了一種含有奈普生的經EY引發的可見光固化的PEGDA片劑，該片劑根據配方中 PEGDA的含量以及固化生物墨水的光照時間來控制其釋放。

 

四、結論、挑戰和展望

 

光聚合水凝膠得到了廣泛的研究。本文綜述了可見光固化3D生物打印方法及可見光引發的光聚合水凝膠的研究現狀，總結了引發劑的類型及其活化機理，并研究了從自由基聚合到硫醇-烯烴“點擊”反應的直接和間接光誘導反應。本文還綜述了近年來可見光交聯水凝膠在組織工程中的幾種常見生物醫學應用。然而，可見光誘導的3D生物打印體系和相應的水凝膠仍具有更多的潛在應用領域。

 

在過去的幾年里，3D生物打印技術取得了顯著的進步。由于其發展潛力和應用多樣性，光固化3D生物打印技術得到了廣泛的研究和發展。光固化3D生物打印技術的發展趨勢引人注目。生物打印領域的一些共同挑戰必須得到解決。其中包含：①打印設備，特別是打印分辨率、印刷保真度和微觀結構復制；②細胞活力，涉及細胞營養和供氧；③生物墨水性能，包括物理強度和生物相容性。此外，在可見光誘導的3D生物打印領域，我們還必須解決光聚合速度和打印結構保真度的問題。這些問題可以通過改善光聚合水凝膠的性能來實現。

 

可見光交聯材料比紫外線誘導的光聚合水凝膠具有更好的性能和更高的應用潛力。雖然可見光比紫外線的細胞毒性低，但它也有局限性。普通可見光引發劑的活化一般需要共引發劑和共單體的存在。例如，EY活化需要三乙醇胺作為共引發劑，NVP作為共單體。因為它們需要在相對較高的濃度下進行，而且由于共引發劑的細胞毒性，它們的應用受到了限制。應該在不增加細胞毒性的情況下，通過提高凝膠效率來克服這一缺點。解決這一問題的方法之一是提高光強或減少含有多官能團的鏈。成功克服這些問題后，可見光誘導的3D生物打印可以有效地集成到組織工程中。

 

3D生物打印和組織工程在方法和材料方面取得了相當大的進展。可見光交聯水凝膠可以像紫外線交聯水凝膠一樣快速地進行光聚合，從而實現適當的機械強度和所需的空間結構。因此，這些水凝膠已經成為3D生物打印和組織工程的通用生物材料平臺。近年來的進展賦予了可見光交聯水凝膠諸多優點，如與不同類型細胞的高細胞相容性、通過結構調節強度和更廉價的交聯裝置。此外，可見光生物打印還有許多潛在的應用領域，如疾病模型和藥物篩選。與在培養皿中培養相比，生物打印技術能更方便地在體外觀察細胞在3D空間內的動態通信行為。水凝膠模擬ECM的組成，可以精確模擬體內的動態變化以及自然組織的功能。此外，光聚合水凝膠在空間布局上的微觀結構設計和調整也更加方便。總體而言，可見光誘導的生物打印對未來的組織再生和生物醫學工程具有很高的價值。