我們?cè)谶M(jìn)行一個(gè)方法驗(yàn)證時(shí)，最好也必須準(zhǔn)備一個(gè)方案，按照此方案進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，避免臨時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)造成不必要的錯(cuò)誤。此文將探討一下有關(guān)物質(zhì)驗(yàn)證的方案設(shè)計(jì)。

 

有關(guān)物質(zhì)驗(yàn)證一般包括專屬性、定量限（如果檢測(cè)限滿足報(bào)告閾值，按照ICH可以不進(jìn)行檢測(cè)限的驗(yàn)證）、線性和范圍、方法精密度、準(zhǔn)確度、中間精密度、耐用性（包括濾膜研究）和溶液穩(wěn)定性。每一個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均應(yīng)滿足系統(tǒng)適應(yīng)性的要求。

 

不管是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，產(chǎn)品有時(shí)有多個(gè)規(guī)格，所有規(guī)格都需要進(jìn)行方法驗(yàn)證嗎？答案是否定的，那么選用什么規(guī)格進(jìn)行方法驗(yàn)證呢？例如，有X（小規(guī)格）、Y（中間規(guī)格）、Z（大規(guī)格）三個(gè)規(guī)格，一般三個(gè)規(guī)格最終供試品溶液濃度一致，建議按如下情況：

 

▍1. 當(dāng)X、Y、Z為等比例處方

 

a．供試品溶液配制：稱取相當(dāng)于一定量（如100mg）的活性成分，則選用任一規(guī)格均可，一般選擇最大Z或最小規(guī)格X。

 

b．供試品溶液配制：轉(zhuǎn)移一定量的片（如5片或10片）至同一規(guī)格容量瓶，則選用最大規(guī)格Z；如果轉(zhuǎn)移至不同規(guī)格容量瓶，母液濃度一致，則同1a。

 

▍2. 當(dāng)X、Y、Z為等片重

 

a．供試品溶液配制：稱取相當(dāng)于一定量（如100mg）的活性成分，則選用最小規(guī)格（輔料最多）。

 

b．供試品溶液配制：轉(zhuǎn)移一定量的片（如5片或10片）至同一規(guī)格容量瓶，則選用最大規(guī)格（原料藥最多，考慮API/雜質(zhì)溶解性的影響）；如果轉(zhuǎn)移至不同規(guī)格容量瓶，母液/最終濃度一致，則選用最小規(guī)格。

 

▍3. 當(dāng)X與Y等比例處方，X與Z等片重

 

a．供試品溶液配制：稱取相當(dāng)于一定量（如100mg）的活性成分，對(duì)于X和Y規(guī)格，則選用任一規(guī)格均可；對(duì)于X和Z規(guī)格，同2a，則選用小規(guī)格X。因此，選用X規(guī)格。

 

b．供試品溶液配制：轉(zhuǎn)移一定量的片（如5片或10片）至同一規(guī)格容量瓶，對(duì)于X和Y規(guī)格，選用大規(guī)格Y；對(duì)于X和Z規(guī)格，則選用最大規(guī)格Z，最終應(yīng)該根據(jù)API溶解性和輔料影響選擇。如果轉(zhuǎn)移至不同規(guī)格容量瓶，母液濃度一致，對(duì)于X和Y規(guī)格，選用任一規(guī)格；對(duì)于X和Z規(guī)格，則選用最小規(guī)格X。因此，選用小規(guī)格X。

 

對(duì)于X、Y、Z的關(guān)系基本為以上關(guān)系，即使關(guān)系稍有不同也可參考上述進(jìn)行規(guī)格選擇。當(dāng)然如果有更多規(guī)格時(shí)，且有些規(guī)格處方之間相似性較小時(shí)，選擇2個(gè)規(guī)格進(jìn)行方案驗(yàn)證有時(shí)也是必要的。

 

我們以主成分外標(biāo)法為例，雜質(zhì)限度假設(shè)如下表：

 

 

1.0溶液配制

 

a．供試品溶液：取20片稱重，研磨均勻，精密稱取相當(dāng)于100mg 活性成分的粉末置于100mL容量瓶，加入稀釋溶解，并定容至刻度，搖勻（如有必要需要超聲）。（1mg/mL）

 

b．標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取20mg主成分標(biāo)準(zhǔn)品置于100mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。精密移取上述溶液5.0mL置于200mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。（5μg/mL）

 

c．建議配制靈敏度溶液：以報(bào)告閾值計(jì)算濃度，一般為0.05%或0.1%的供試品溶液。

 

2.0驗(yàn)證項(xiàng)目

 

系統(tǒng)適用性

 

專屬性

 

定量限

 

線性和范圍

 

精密度

 

準(zhǔn)確度

 

中間精密度

 

耐用性

 

溶液穩(wěn)定性

 

2.1系統(tǒng)適用性

 

序列設(shè)置

 

1針空白稀釋劑（系統(tǒng)穩(wěn)定后）；

 

1針靈敏度溶液；

 

5針或6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液Std

 

1針各供試品溶液

 

1針標(biāo)準(zhǔn)品溶液（每12小時(shí)或序列結(jié)束插入Std）

 

滿足分離度、理論板數(shù)、拖尾因子、信噪比等要求；

 

滿足5針或6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液中主峰峰面積RSD的要求，滿足序列中或末尾插入標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積與前5針或6針主峰峰面積RSD的要求。

 

2.2 專屬性

 

（1）空白溶劑、空白輔料和雜質(zhì)干擾

 

按1.0溶液配制 配制空白溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液。

 

空白輔料：精密稱取相當(dāng)于100mg活性成分的空白輔料粉末（如果不同規(guī)格，包衣粉不一致，各規(guī)格都需分別配制空白輔料）。

 

雜質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液：精密稱量10mg雜質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品置于200mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（50μg/mL）

 

雜質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液：精密稱量10mg雜質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品置于100mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。精密移取上述溶液10.0mL置于50mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。（20μg/mL）

 

混合溶液：精密稱取相當(dāng)于100mg 活性成分的粉末置于100mL容量瓶，分別移取上述雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液10.0mL，加入稀釋溶解并定容至刻度（如有必要需要超聲）。

 

序列設(shè)置：

 

?1針空白稀釋劑（系統(tǒng)穩(wěn)定后）；

 

?1針靈敏度溶液；

 

? 5針或6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液Std

 

? 雜質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液

 

? 雜質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液

 

? 1針混合溶液

 

? 1針標(biāo)準(zhǔn)品溶液（每12小時(shí)或序列結(jié)束插入Std）

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a．空白溶劑和空白輔料對(duì)主成分、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B無(wú)干擾；

 

b．混合溶液中，主成分、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度大于1.5。采用PDA/DAD檢測(cè)器，主成分、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B峰峰純度角小于純度閾值，或峰純度因子大于995。

 

（2）強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)

 

注：（1）選用PDA/DAD檢測(cè)器，選用200nm-400nm波長(zhǎng)。

 

（2）一般至少有一個(gè)破壞條件產(chǎn)生雜質(zhì)的量在5-20%，如果降解條件比較劇烈使大部分原料發(fā)生降解，應(yīng)采用溫和條件或縮短時(shí)間再進(jìn)行試驗(yàn)；如果最劇烈的條件下，降解的雜質(zhì)量仍小于5%，說(shuō)明活性成分比較穩(wěn)定，無(wú)需采用更劇烈的條件。

 

溶液破壞：

 

? 未破壞條件樣品

 

? 加熱條件破壞樣品：一般溶液60℃水浴加熱

 

? 酸性條件破壞樣品：一般采用0.1mol/L-1.0mol/L鹽酸

 

? 堿性條件破壞樣品：一般采用0.1mol/L-1.0mol/L氫氧化鈉

 

? 氧化條件破壞樣品：一般采用0.1%-3%過(guò)氧化氫，中性條件下破壞7天。

 

? 光照射條件破壞樣品：至少照射1.2×106 Lux*h，紫外能量不低于200w*h/m2

 

固體破壞：

 

?高溫高濕條件破壞樣品：建議50-60℃（高于加速試驗(yàn)溫度10℃），相對(duì)濕度75%或更高。

 

? 光照條件破壞樣品：至少照射1.2×106 Lux*h

 

 對(duì)于國(guó)內(nèi)申報(bào)，可以不做固體破壞（因有影響因素試驗(yàn)5天/10天）

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a．破壞樣品溶液和未破壞樣品溶液中，主成分與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度大于1.5。采用PDA/DAD檢測(cè)器，主成分峰純度角小于純度閾值，或峰純度因子大于995。

 

b．物料平衡在90%-110%，如果不平衡給出合理的解釋。

 

2.3 定量限

 

以報(bào)告閾值或小于報(bào)告閾值作為定量限，根據(jù)ICH日劑量大于1g，報(bào)告閾值為0.05%；日劑量小于等于1g，報(bào)告閾值為0.1%。當(dāng)定量限大于報(bào)告閾值時(shí)，一般可認(rèn)為方法的靈敏度較低，但如果雜質(zhì)限度遠(yuǎn)大于報(bào)告閾值，小編認(rèn)為也可以接受。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a．6針定量限溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不得過(guò)15%；

 

b．主成分、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的信噪比不小于10。

 

2.4 線性和范圍

 

雜質(zhì)A溶液：精密稱量12.5mg雜質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品置于50mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（250μg/mL）

 

雜質(zhì)B溶液：精密稱量10mg雜質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品置于100mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（100μg/mL）

 

主成分工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱量12.5mg主成分標(biāo)準(zhǔn)品置于50mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（250μg/mL）

 

線性儲(chǔ)備溶液：分別取上述溶液各10.0mL至50mL容量瓶中，稀釋劑定容至刻度，搖勻。

 

LOQ儲(chǔ)備溶液：分別取上述雜質(zhì)A溶液和主成分溶液各1.0mL，雜質(zhì)B溶液2.5mL至50mL容量瓶中，稀釋劑定容至刻度，搖勻。

 

一般配制從定量限至120%或150%限度濃度的溶液。按照下表進(jìn)行線性溶液制備。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)： 相關(guān)系數(shù)大于0.9900。

 

 

2.5 精密度

 

制備6份供試品溶液，如果供試品溶液中雜質(zhì)A或雜質(zhì)B含量小于報(bào)告閾值，需制備6份100%添加樣品溶液，考察方法的精密度。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、最大未知雜質(zhì)（大于報(bào)告閾值）和總雜質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足下表。

 

 

2.6 回收率

 

制備3個(gè)水平準(zhǔn)確度溶液，分別為L(zhǎng)OQ×3，100%×3和120%×3。通過(guò)樣品粉末或輔料空白中添加一定量的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液或主成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液，考察方法的準(zhǔn)確度。

 

（1）已知雜質(zhì)準(zhǔn)確度

 

使用2.4線性和范圍項(xiàng)下LOQ儲(chǔ)備溶液和線性儲(chǔ)備溶液，精密稱取相當(dāng)于100mg 活性成分的粉末置于100mL容量瓶，按下表加入相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其他同供試品溶液處理。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a.    雜質(zhì)A回收率在90%-110%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得過(guò)10%。

 

b.    雜質(zhì)B回收率在80%-120%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得過(guò)10%。

 

 

（2）  未知雜質(zhì)準(zhǔn)確度

 

主成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱量10mg活性成分標(biāo)準(zhǔn)品置于50mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。精密移取上述溶液10.0mL置于100mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。（20μg/mL）

 

精密稱取相當(dāng)于100mg 活性成分的空白輔料粉末置于100mL容量瓶，按下表加入相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其他同供試品溶液處理。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：活性成分回收率在80%-120%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得過(guò)10%。

 

 

2.7 中間精密度

 

由第二個(gè)實(shí)驗(yàn)者在不同天采用不同的色譜柱、不同液相色譜等，采用同一批號(hào)的樣品進(jìn)行中間精密度實(shí)驗(yàn)。

 

制備6份供試品溶液，如果供試品溶液中雜質(zhì)A或雜質(zhì)B含量小于報(bào)告閾值，需制備6份100%添加樣品溶液，考察方法的中間精密度。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a．雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、最大未知雜質(zhì)（大于報(bào)告閾值）和總雜質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足2.5項(xiàng)下表格。

 

b．兩個(gè)分析者測(cè)定雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和最大未知雜質(zhì)（大于報(bào)告閾值）相對(duì)偏差滿足下表。

 

 

2.8 耐用性

 

（1） 通過(guò)變動(dòng)色譜柱、柱溫、流速、緩沖鹽pH和有機(jī)相比例等考察方法的耐用性。

 

（2）根據(jù)稀釋劑的性質(zhì)，選擇至少兩種濾膜考察不同濾膜的影響，收集第1mL、2mL、3mL、4mL和5mL，如果還不滿足標(biāo)準(zhǔn)，需繼續(xù)進(jìn)行。

 

 

制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，如果供試品溶液中雜質(zhì)A或雜質(zhì)B含量小于報(bào)告閾值， 需采用100%添加樣品溶液代替供試品溶液，考察方法的耐用性。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a．滿足系統(tǒng)適用性要求。

 

b．各條件下測(cè)定雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和最大未知雜質(zhì)（大于報(bào)告閾值）與正常條件下結(jié)果的偏差滿足下表。

 

 

2.9 溶液穩(wěn)定性

 

配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液（如果雜質(zhì)A或雜質(zhì)B含量小于報(bào)告閾值，建議采用100%添加溶液）在室溫和冷藏條件下在0h、12h、24h和48h考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)：各時(shí)間下測(cè)定雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和最大未知雜質(zhì)（大于報(bào)告閾值）與正常條件下結(jié)果的偏差滿足下表。

 

 

3.0結(jié)語(yǔ)

 

此方案設(shè)計(jì)的觀點(diǎn)不代表官方觀點(diǎn)。本文是小編根據(jù)ANDA項(xiàng)目研發(fā)經(jīng)驗(yàn)和多個(gè)產(chǎn)品FDA回復(fù)意見(jiàn)總結(jié)設(shè)計(jì)。