液相色譜壓力異常

 

液相系統壓力產生的原因在于流動相流經管路及色譜柱時會有阻力，即所謂的反壓或系統壓力。漏液會引起系統壓力的降低，而堵塞會引起系統壓力的飆升。

系統壓力的單位有：巴（Bar）、兆帕（Mpa）和磅／平方英吋（psi），它們之間的換算關系為１Bar＝0.1Mpa＝14.5psi。

 

１、影響因素

 

影響系統壓力的因素主要有流動相的溶劑組成、溫度及流速這三方面：

１）流動相的粘度是產生反壓的主要原因，下圖為有機溶劑－水的粘度隨組成與壓力的關系圖：

 

 

由上圖可以看到，乙腈－水比例為（20:80）、甲醇－水比例為（40:60至50:50）時，系統的壓力最大。因此，在做實驗時應盡量避開這個比例范圍。另外，異丙醇粘度大，一般不作流動相使用。

２）流速對反壓的影響是線性關系，流速增加，反壓亦增大。

３）溫度對反壓的影響是反比關系，溫度升高，反壓降低，對某些流動相的影響更大一些。

４）液相色譜儀各模塊之間的連接管路也會產生壓力，系統壓力與管路的長度成正比，與管路直徑的四次方成反比（1/4D）。上述考慮的是柱外因素對系統壓力的影響，色譜柱對系統壓力的影響也很大，反壓與色譜柱長度成正比，與填料顆粒度的平方成反比（2.5μｍ填料比3.5μｍ填料反壓高）。

 

２、壓力原因

 

具體到壓力問題的表現形式上，主要有壓力高、壓力低或沒有壓力以及壓力不穩：

①造成壓力高問題的主要原因有：

１）溫度太低；

２）流速太高；

３）流動相粘度大；

４）管路堵塞；

５）儀器或色譜柱堵塞；

６）壓力傳感器問題。

系統壓力高的故障排除流程圖如下：

 

 

②產生壓力低情況的可能原因：

１）系統內有滲漏處；

２）單向閥堵塞；

３）入口管路有氣泡；

４）溶劑濾頭堵塞；

５）所用溶劑不正確，儲液瓶中無溶劑；

６）溫度太高，流速太低；

７）泵未輸送流動相；

８）泵關閉或保險絲斷了。

 

 

以上為儀器單向閥的結構示意圖，如果某些原因造成寶石球與球基座發生黏結，造成液體不能進入到泵中，從而造成泵的壓力偏低。

 

３、造成壓力波動可能的原因有：

１）脫氣機排氣不充分；

２）流動相未正確脫氣；

３）所用溶劑不混溶或易揮發；

４）壓力傳感器及泵問題。

其中，大多數的壓力波動都是由于氣泡引起的（如下圖）：

 

 

基線噪音問題

 

１、基線噪音大

 

１）流動相中有氣體–溶劑脫氣；

２）流動池中有氣泡–在出口處使用0.009”的管路；

３）色譜柱上的污染物被洗脫–平衡系統，直至基線穩定；如樣品中有保留非常強的組分，可設置強洗脫程序；

４）滲漏–此時應修復滲漏，重新連接或更換接頭；

５）檢測器燈能量低–更換燈；

６）靈敏度太高–使用合適的采樣頻率，調節增益（如ELSD檢測器）；

７）檢測器流動池臟–清潔流動池；

８）電噪音–除去電噪音的來源：屏蔽電纜，清潔觸點；

９）采樣頻率設置過大–一味追求高采樣頻率，可能對靈敏度沒有任何幫助，同時也會產生比較大的噪音：UV檢測器推薦降低采樣頻率，HPLC推薦1-5Hz，UPLC推薦20Hz。

 

2、同步的基線噪音

 

 

１）大多數情況下都是泵引起的，泵頭中存在空氣–將溶劑脫氣，并重新灌注泵；

２）單向閥問題–超聲清洗單向閥或更換；

３）柱塞桿斷裂–更換；

４）混合問題–更換一個體積更大的Mixer，以增加系統體積；

５）電噪音–改變電路，除去來源。

 

３、不同步的基線噪音

 

 

１）氣泡—流動相要脫氣；

２）檢測器中有氣泡／空氣—流動相脫氣，或在檢測器的后面加反壓（不適用于RI檢測器）；

３）滲漏—特別是肉眼無法發現的微漏或者泵的內漏，會造成流速的變化和混合比例的變化，從而導致基線噪音，此時應修復滲漏，重新連接或更換接頭；

４）管路堵塞—除去堵塞，沖洗系統；

５）電噪音—除去來源，改變電路。

 

４、基線漂移：上漂或者下漂

 

 

１）梯度變化引起，如溶劑Ｂ的吸收值高于溶劑Ａ–使用基線差減，或嘗試新的流動相；

２）化合物從色譜柱上洗脫–平衡系統，直至基線穩定；如樣品中有保留非常強的組分，可設置強洗脫程序；

３）溶劑改變（氣體吸附，蒸發）–氦氣脫氣，隔離溶劑；

４）溶劑滲漏–擰緊或者更換接頭；

５）檢測器溫度影響（尤其是示差，電化學以及電導檢測器）–流動池溫度調節；

６）柱溫波動–等待柱溫平穩，使用柱預加熱器；

７）壓力變化–過濾溶劑以及樣品，或樣品太粘稠；

８）混合問題–更換一個體積更大的Mixer，以增加系統體積。

 

５、Cyclic基線

 

 

１）溫度影響–隔離熱源，或搬離臨近的通風口，或增加流動池溫度；

２）混合問題–更換一個體積更大的Mixer，以增加系統體積；

３）流動相中的氣體–溶劑脫氣；

４）泵不穩定–檢查維修泵；

５）管路堵塞–沖洗系統，排除并除去堵塞源頭；

６）電問題–改變電路，或除去根源。

 

６、基線上的毛刺

 

 

１）氣泡–溶劑脫氣，并重新灌注泵，流動相脫氣越好，基線就會越好；

２）信號連接不好，連線變松–清潔并擰緊檢測器上的導線，或檢查連線是否有損壞，或更換鏟形接線片；

３）燈繼電器試圖點燃熄滅的燈–更換燈；

４）電噪音–更換電路，或除去根源。

 

７、小結

 

１）確保無電源及電噪音干擾；

２）為避免基線噪音，確保儀器系統內無氣泡或空氣，流動相首選過濾脫氣；排盡管路、進樣器、檢測池中的氣泡；選擇合適的接頭和管路，防止滲漏；

３）在編輯方法時，針對HPLC和UPLC儀器UV檢測器設置合適的采樣頻率，HPLC推薦1-5Hz，UPLC推薦20Hz；

４）保持良好的操作習慣，如UPLC儀器水相流動相每天更換，添加了緩沖鹽的流動相過0.2μｍ溶劑過濾膜等，都會減小基線噪音的產生。