藥物的質量研究與質量標準的制定是藥物研發過程的重要研究內容之一，貫穿于研發的整個生命周期。在藥物質量研究工作中，分析方法學的開發及驗證是其重要的組成部分之一。分析方法開發驗證的目的是判斷所采用的分析研究方法是否科學、合理，能否有效控制藥品的內在質量特性，做到質量可控。本文旨在和大家一起交流溶出度方法學驗證內容的一般研究思路，如有存在表述不當之處還請各位批評指正。

溶出度方法學驗證的步驟主要有：1）初步確定分析方法，UV法或HPLC法；2）制定驗證的方案，包括前期文獻材料調研、驗證目的、驗證項目及不同項目驗證的可接受標準；3）開始驗證工作，積累收集數據及相應圖譜；4）對驗證的結果進行判斷，評價分析方法是否通過驗證。

溶出度方法學驗證的項目與其他分析方法基本一致，常規驗證項目包括：專屬性、線性及范圍、準確度、精密度和耐用性等，方法驗證的指導原則可參考中國藥典、ICH Q2（A/B）、USP通則<1225>、<1226>、<1092>等。

1. 專屬性

專屬性系指在其他成分（如雜質、降解產物、空白輔料等）存在時，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。專屬性測定環節，應分別分析加有雜質、降解產物等控制成分的樣品和實際樣品，比較兩組測試結果，結果合格的標準應該為：空白溶劑對主峰的檢測無干擾，不超過1%；主成分與有關物質完全分離，分離度r≥1.5；峰純度符合相應規定。

輔料對專屬性的干擾：空白輔料是指除了活性成分以外的所有輔料和包衣材料，還包括油墨和膠囊殼。具體操作方法可按處方比例配制空白輔料（含油墨或膠囊殼）的混合樣品，將該混合樣品溶解或分散在溶出介質中，然后向溶液中加入一定量藥物，作為供試品溶液，可接受標準為：輔料（包括膠囊殼等基質）對主峰的檢測無干擾，不能超過2.0%。

對于溶出實驗方法而言，還需要特別注意的一點是：取樣時所采用的過濾裝置，如濾膜、濾頭等，必須要經過藥物的吸附驗證，防止對測定結果產生一定干擾，這一部分應在溶出方法開發階段做充分論證研究。

2. 線性和范圍

可取對照品適量，按照標準方法配置一系列濃度的溶液。一般操作是在容量瓶中配成一定濃度的儲備液，分別精密移取儲備液適量，稀釋成系列濃度的溶液，通常至少使用5個濃度點（參見<1225>），1225中說明：對原料或成品藥（制劑）的含量測定：一般應在測試濃度的80-120%，該范圍是應考慮的最小規定范圍，若超出此范圍，應有正當理由，主要是根據劑型的特點；對于溶出度試驗，應為規定范圍的±20%，例如如果是控釋制劑，規定1h后達到20%，24h達到90%，它的驗證范圍應為標示量的0-110%。另外，若線性貯備溶液制備過程中為了增加藥物的溶解度，可能會用到有機溶劑，除非經過驗證外，有機溶劑的量均不得超過總體積的5%（v/v）。

例如取頭孢克肟對照品55.37mg，置100ml容量瓶中配置為儲備液，然后就依次精密移取稀釋成一系列梯度濃度，以濃度為縱坐標，相應峰面積為橫坐標進行線性回歸，結果表明頭孢克肟濃度在0.48-477.84μg/ml范圍內，進樣量在9.34-9337.66ng范圍內，進樣量與峰面積呈良好線性關系。

3. 準確度

準確度即回收率實驗?；厥章试囼災康氖强疾觳捎脭M定方法測定結果與真實值或參考值接近的程度，且應應在規定的線性范圍內進行試驗。在回收率實驗進行之前，USP1092建議：在回收率實驗之前，過濾器、濾膜等對藥物的吸附要進行全面評估，同時要設法排除由于儀器的玻璃材質部分對樣品吸附而對測定結果造成的干擾影響。

具體的實驗方法包括：在規定范圍內，取同一濃度（相當于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測定結果進行評價；或考慮設計至少三種不同濃度，每種濃度至少平行配制3份，用至少9份樣品的測定結果進行評價，回收率驗證的濃度范圍一般要求為限度的±20%。兩種分析方法的選定應考慮分析的目的和樣品的濃度范圍?；厥章使┰嚇悠啡芤号渲疲喊刺幏奖壤旌系目瞻纵o料+不同濃度的主成分對照品或原料，再按照擬定的質量標準配制溶液，必要時可超聲使主成分溶解。配制溶劑盡量與溶出介質體系一致。如果藥物溶解性較差，可以將藥物溶解在少量有機溶劑（一般不超過5%）中制備儲備液，并用溶出介質稀釋到最終濃度?？山邮軜藴室话銥椋焊鳚舛认碌钠骄厥章蕬?8%-102%之間，相對標準偏差RSD應不大于2.0%。例如取頭孢克肟對照品適量各三份，按照100%比例加入空白輔料，加溶出介質振搖溶解，作為50%、75%和100%供試溶液，回收率結果表明其方法回收率良好。

4. 重復性

重復性即在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內，由同一分析人員測定所得結果的精密度?？稍谝幎舛确秶鷥?，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品溶液的測定結果進行評價；或設計至少三種不同濃度，每種濃度分別制備至少三份供試品溶液進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價（濃度設定應考慮樣品的濃度范圍）。實際實驗操作中，可能有幾種方法，方法一：取6個單獨制劑分別測定溶出度，計算RSD，但該方法測定時受制劑個體差異影響比較大，如果測定結果重復性不好，可能是因為制劑含量差異所導致，用該方法時最好是挑選質量較好，例如含量均勻度較好的片劑進行實驗；方法二即取供試品1片（粒），置于一個溶出杯中，按照溶出度方法測定，至規定取樣點時去處六份供試液分別測定溶出度計算RSD值。結果接受標準為RSD不超過2.0%。例如取頭孢克肟顆粒6袋，按照溶出度方法進行溶出，30min取溶出液濾過，進樣計算溶出度，結果表明該溶出測定方法重復性良好。

5. 中間精密度

中間精密度即在同一實驗室內的條件改變，如不同時間、不同分析人員、不同設備等測定結果之間的精密度。研究過程中的典型的變化，包括不同天、不同操作人員和設備。USP 1092中建議：可選用同一批次質量特征較好的制劑（如較好的含量均勻度）的溶出試驗可以由同一實驗室至少兩個不同的分析人員進行，每個分析人員制備標準溶液和溶出介質和依據明確的提取和定量步驟進行。通常情況下，分析人員用不同的溶出液、分光光度計或HPLC（包括色譜柱）和自動進樣器，在不同天進行試驗。可接受標準：USP 1092建議：當該時間點的溶出量小于85%時，兩個分析員溶出結果的平均值相差不得超過10%；當該時間點的溶出量大于85%時，兩個分析員溶出結果的平均值相差不得超過5%。當然，具體的可接受標準可根據特定產品做具體規定。

6. 溶液穩定性

溶液穩定性考察的具體時間區間可根據不同的項目需求去做不同的考察。穩定性包括對照品溶液穩定性和供試品溶液穩定性。對照品溶液穩定性：取對照品溶液適量，在室溫下放置，分別于不同時間點測定吸光度值，計算其RSD值；供試液穩定性：取自制樣品適量，用相應介質制備成供試液，在室溫下放置，分別于不同設置時間點測定吸光度值，計算其RSD值。對于UV法測定的供試液，一般穩定性做到24小時即可，緩控釋制劑可相對延長時間；對于HPLC法測定的供試液，一般需滿足一條溶出曲線所有樣品測定完全的時間。如果溶液不穩定，還需要考慮溫度（需要冷藏）、避光（透明容量瓶+棕色容量瓶）、以及容器材料（塑料或玻璃）等對穩定性結果的影響?？山邮軜藴室话銥椋喝∶繒r間點的吸光度值，計算其RSD，應不大于2%，則說明該溶液在此時間段內的穩定性良好。

7. 耐用性

耐用性主要評估溶出條件故意做微小改變時對溶出方法耐用性的影響。對于該實驗，最好選用具有較好質量特征（如具有較好含量均勻度）的制劑批次進行，排除制劑個體差異對該結果造成的干擾。HPLC法可根據具體情況考慮流動相組分差異、流速、PH值、色譜柱類型、分離溫度、波長等變化對測定結果耐用性的影響；UV測定方法可結合不同項目溶出度方法的具體情況對表面活性劑濃度、pH值、溶出介質是否脫氣處理、轉速、溫度、體積、取樣時間、不同型號品牌的溶出儀等進行方法的耐用性研究，對比溶出條件的微小變化對產品測定結果的影響。例如若選擇的溶出介質是緩沖液介質體系或是含有表面活性劑的介質體系，需要做pH值變化、表面活性劑濃度變化對溶出速度的影響，以確定溶出介質的耐用性。根據品種特點考察耐用性，推薦但不僅限于上述變動條件。

8. 溶出均一性

溶出均一性試驗包括批內均一性和批間均一性。這兩項指標既能檢驗藥品本身質量特性是否符合規定，同時也可以檢驗溶出方法是否滿足準確性、精確性良好的要求。批內均一性可取同一批次產品的6或12個劑量單位測定溶出曲線，計算各取樣時間點的RSD值。其中，早期的一些取樣時間點（如5min），要求RSD≤20%；其他時間點，要求RSD≤10%。批間均一性：取不同批次產品的6或12個劑量單位測定溶出曲線，比較各批次的溶出曲線是否相似。

綜上，溶出方法驗證的一般項目基本如上幾項，當然并不局限于該些項目，具體的驗證項目及可接受標準可根據產品自身特點所設定。

參考文獻：

[1]. 《中國藥典》2020年版四部<9101>：分析方法驗證指導原則

[2].  USP通則< 1092>、< 1225>          

[3]. 山廣志，藥物制劑質量研究——方法選擇與驗證

[4]. 胡利敏，楊麗，頭孢克肟顆粒溶出曲線方法學驗證[J]. 中國抗生素雜志,2017,5(42):373-376.