微生物檢測(cè)人員天天都需要在無(wú)菌室工作，在超凈臺(tái)或者生物安全柜里操作，為了保證我們檢測(cè)的準(zhǔn)確性，我們必須要求無(wú)菌室以及工作臺(tái)符合要求，那我們應(yīng)該怎樣進(jìn)行驗(yàn)證呢？下面我們介紹一下實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌室環(huán)境中無(wú)菌或殺菌效果應(yīng)如何檢查。

一、紫外燈殺菌效果檢查

紫外燈在使用過(guò)程中輻射強(qiáng)度會(huì)逐漸降低，影響其殺菌效果，故應(yīng)該定期檢查。紫外燈的殺菌有效波長(zhǎng)是253.7nm，其強(qiáng)度可以用中心波長(zhǎng)254nm的紫外線強(qiáng)度計(jì)測(cè)定。在沒(méi)有紫外線強(qiáng)度計(jì)的情況下可以采用生物學(xué)替代。

生物學(xué)測(cè)試簡(jiǎn)要步驟如下：選用枯草芽孢桿菌ATCC 9372，制成106CFU/mL~108CFU/mL濃度的菌懸液；選用經(jīng)脫脂處理的0.5cm×1.0cm大小的布片或鋁片，高壓滅菌后用作載體；每個(gè)載體上滴一滴制備好的菌懸液，干燥后備用；將8個(gè)染菌載體放于無(wú)菌器皿中，置于紫外燈下1m~1.5m處，開啟紫外燈照射，于0.5h、1h、1.5h和2h各取出2個(gè)染菌載體，分別投入盛有5mL緩沖蛋白胨水的洗脫液；系列稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)；同法取8個(gè)染菌載體用做陽(yáng)性對(duì)照，操作除不經(jīng)紫外此昂照射外與試驗(yàn)組相同。

殺滅率=（陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)-試驗(yàn)組回收菌數(shù)）/陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)×100%

殺滅率大于99.9%時(shí)，認(rèn)為紫外燈殺菌效果合格。

二、無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查

無(wú)菌室空氣質(zhì)量的檢查應(yīng)按照采樣計(jì)劃，根據(jù)情況對(duì)處于空態(tài)、靜態(tài)或正常運(yùn)行的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，使用適當(dāng)?shù)膬x器采集空氣中微生物，測(cè)定并監(jiān)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)空氣的微生物污染。無(wú)菌室空氣質(zhì)量的檢查可以參考GB/T 16293《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌的測(cè)試方法》和GB/T 25915.7《潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第7部分：隔離裝置(潔凈風(fēng)罩、手套箱、隔離器、微環(huán)境)》。

空氣懸浮微生物的采樣和計(jì)數(shù)方法多種多樣，根據(jù)所需采樣目的決定具體的采樣方法和采樣器。因采樣器的采集效率不同，應(yīng)慎重選擇合適的方法和設(shè)備。

采樣器分為兩類：被動(dòng)式采樣器，如落菌盤；主動(dòng)式采樣器，如濾過(guò)采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。

1、沉降法

落菌盤等被動(dòng)式空氣微生物采樣器不能測(cè)量空氣中的微生物的總數(shù)，而是測(cè)量空氣中微生物在表面的沉降率。只要確定單位時(shí)間落菌盤上微生物的數(shù)量，再根據(jù)落菌盤的暴露面積與暴露時(shí)間之間的關(guān)系，即可大致計(jì)算出空氣中微生物的數(shù)量。

面積小于30m2的室內(nèi)設(shè)一條對(duì)角線取3點(diǎn)，在其中心以及兩端距墻1m處各取1點(diǎn)；面積大于30m2的室內(nèi)房間四面距墻1m和中央各放置一個(gè)平皿，高度為實(shí)驗(yàn)臺(tái)高度。培養(yǎng)基平皿開蓋暴露10min，然后蓋上蓋子倒放，培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)每個(gè)平皿上的菌落數(shù)。

日常監(jiān)控時(shí)，可以設(shè)定可接受的菌落數(shù)限值。一般無(wú)菌室所有的取樣平皿上的細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于15個(gè)。空氣質(zhì)量良好的無(wú)菌室，通常么個(gè)平皿上生長(zhǎng)的細(xì)菌不超過(guò)2個(gè)。

也可以按式估算空氣中的細(xì)菌濃度：

C=（50000xN ）/（A × t）.......

式中：

t一平板暴露時(shí)間，單位為分鐘(min) ;

N-平均菌落數(shù)，單位為每1L(CFU/L)。

2、空氣過(guò)濾法：

空氣采樣除了自然沉降法外，還可以使用專門的主動(dòng)式采樣器。主動(dòng)式采樣器可以評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)區(qū)空氣微生物的特征。主動(dòng)式采樣器主要包括過(guò)濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。

撞擊采樣器可以分為狹縫式采樣器、離心式采樣器和針孔式采樣器。狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣，通過(guò)采樣器的縫隙式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉(zhuǎn)的平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后形成菌落，予以計(jì)數(shù)。離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心機(jī)的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時(shí)間撞擊到專用的固形培養(yǎng)條上，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落，予以計(jì)數(shù)。

過(guò)濾式空氣采樣器是最常用、最簡(jiǎn)單的空氣采樣器。過(guò)濾式采樣器有采樣頭、濾器、流量計(jì)和抽氣泵組成。過(guò)濾式采樣器的結(jié)構(gòu)如圖：

開動(dòng)電機(jī)后，抽氣泵工作，帶動(dòng)空氣吸入采樣頭，空氣通過(guò)濾器的時(shí)候，大于濾膜孔徑的顆粒被阻留，當(dāng)達(dá)到預(yù)先設(shè)定吸氣體積后抽氣泵停止工作，將濾膜取出轉(zhuǎn)貼到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后計(jì)算空氣中微生物的濃度。過(guò)濾式采樣器捕獲效率高，但是濾膜材料可能影響微生物的存活率，還有采樣阻力大、流量易變的缺陷。

在沒(méi)有空氣采樣器的情況下，可以自己組裝如下圖的空氣錯(cuò)率采樣裝置，注意組裝連接處必須密不透風(fēng)。

打開圖中大瓶的龍頭，空氣就被抽入無(wú)菌水中。待4L水流完，就有4L空氣通過(guò)小瓶中的無(wú)菌水，也就是4L空氣中的微生物被留存在50mL無(wú)菌水中。無(wú)菌吸取1mL過(guò)濾的水樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，做2個(gè)平行。37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。

每升空氣中的細(xì)菌數(shù)為：2個(gè)平皿上細(xì)菌數(shù)量的平均值×50/4。

三、無(wú)菌室物體表面微生物污染檢查

表面微生物污染的檢查需要使用接觸器或拭子，獲得某表面某時(shí)間點(diǎn)的微生物數(shù)量。

接觸器以容器內(nèi)已知面積的固態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)與表面接觸，接觸面積應(yīng)大于20cm2，均勻用力將整個(gè)營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)壓住表面幾秒鐘，不得移動(dòng)。然后將裝置放回容器內(nèi)，再清潔采樣表面，清除殘留營(yíng)養(yǎng)物。接觸器培養(yǎng)后顯現(xiàn)的菌落可以給出原表面微生物的存活狀況的鏡像“圖”。

使用拭子更為簡(jiǎn)單和靈活，用拭子擦拭某個(gè)表面，它抹去的微生物數(shù)量就可以計(jì)算出了。對(duì)接觸裝置觸及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面，用拭子采樣特別方便。棉拭子的操作方法如下：

準(zhǔn)備材料：自制無(wú)菌棉拭子或購(gòu)買商品化的無(wú)菌棉拭子、內(nèi)徑10cm×10cm無(wú)菌規(guī)格板、無(wú)菌生理鹽水、培養(yǎng)基平皿。

如果取樣物體是平面的，將無(wú)菌規(guī)格板放在物體表面，用浸濕的無(wú)菌棉拭子在無(wú)菌規(guī)格板空心處橫豎涂抹均勻，涂抹時(shí)隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，剪去棉拭子與手接觸部分，將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌生理鹽水中待檢。

將采樣管敲打80次以上是棉拭子上的細(xì)菌充分?jǐn)U散，做適當(dāng)稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。

細(xì)菌總數(shù)（CFU/cm2）=（平皿上菌落平均數(shù)*稀釋倍數(shù)）/采樣面積（cm2）

【例10.1】某操作臺(tái)面采樣面積100cm2,棉拭子放入10mL生理鹽水，從中取1mL檢測(cè)，平皿上平均菌落數(shù)為5個(gè)。則細(xì)菌總數(shù)為：

5x10/100=0.5(CFU/cm2)

如果取樣物品表面不規(guī)則或者物品采樣面積不足100cm2,取整件物品進(jìn)行棉拭子涂抹取樣，其余步驟同上。

細(xì)菌總數(shù)(CFU/件)=平皿上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/件

四、人員接觸面無(wú)菌檢查

人員與檢測(cè)對(duì)象的接觸面主要是手。

被檢人員洗手消毒后，五指并攏。將浸泡過(guò)的棉拭子沿雙手指屈從指根到指端往返涂擦兩次，涂擦的同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子。剪去操作者手接觸部位，將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌室生理鹽水中待檢。

按“無(wú)菌室物體表面細(xì)菌污染檢查”的方法進(jìn)行樣品處理、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和報(bào)告結(jié)果。