摘要: “?；?rdquo;是基因毒警示結構，在含有水、醇或胺類等物質環境中極不穩定，分析方法開發難度極大，采用衍生化后測定是一個不錯的選擇，但是衍生化試劑如何選擇，非常關鍵，本文以氯磺酸異氰酸酯為例，展示分析方法開發全過程，不足和缺陷之處，望同行批評指正。

一、化合物性質

本品具有 “酰基氯”基因毒警示結構，易吸濕，在空氣中形成煙霧，遇水劇烈反應生成氨基磺酸、氯化氫和二氧化碳。可溶于氯化烴、乙腈。沸點：107℃，分子量141.53。

“酰氯”在含有水、醇或胺類等物質環境中極不穩定。

二、衍生化試劑的選擇

思路1，采用小分子醇與其進行衍生化生成酯，在通過GC-MS進行采集，衍生機理如下：

結果：本品分別與甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇反應，采用GC-MS進行檢測，峰型良好，但方法靈敏度無法滿足1ppm的限度要求。

圖1：GC-MS譜圖

思路2，進一步考慮選擇含芳香集基團的醇或胺與其進行衍生，然后采用LC-MS/MS方式進行采集，衍生機理如下：

結果：采用氯磺酰異氰酸酯與苯胺衍生，以二氯甲烷為溶劑，產生的衍生物較多，以乙腈為溶劑（5%的甲醇助溶），產生的衍生物相對單

一，便于定量，譜圖如下所示：

圖以二氯甲烷為溶劑的衍生化結果

圖以乙腈為溶劑的衍生化結果

三、檢測方法的優化

3.1、衍生化時間對產物的影響

氯磺酰異氰酸酯與苯胺反應立即生產白色固體并伴有白霧，快速反應，衍生時間考察5min，10min，20min。

結論：該反應快速，5min已完成全部反應，衍生時間的延長對衍生效果基本無影響。

3.2、衍生試劑用量對反應的影響

取氯磺酰異氰酸酯約30mg，分別加入不同體積的衍生化試劑進行反應，根據衍生化試劑的反應當量，分別加入1倍反應當量，2倍反應當量及3倍反應當量。

結論：隨著衍生化試劑量的增加，衍生產物的量也隨之增加，當加入量大于2倍理論量后，衍生產物的量基本不再增加，表明加入至少2倍理論量的衍生試劑時能保證衍生完全。

3.3、色譜條件的選擇

根據上述條件，進一步進行色譜條件的優化：

條件一、流動相：10mmol甲酸銨水溶液（用甲酸調節pH值3.5）-乙腈（45:55），柱溫30℃，流速0.3ml/min，進樣量5μl，運行時間5min，色譜柱，C18色譜柱（2.1*150mm，3μm），質譜條件，電噴霧離子化源（ESI），多反應監測（MRM，290.2/170.9），離子源溫度300℃，脫溶劑管溫度250℃，霧化氣流速（N2）3L/min，加熱器流速15L/min，干燥器流速10L/min；CE電壓13.0V。

條件二、多反應監測（MRM，290.2/78.06），其他同條件一

條件三、反應監測（MRM，290.2/92.10），其他同條件一

結論：多反應監測（MRM，290.2/170.9）條件下，方法靈敏度最高。

條件四、固定“多反應監測（MRM，290.2/170.9）”條件，CE電壓分別設定為13V、15V及20V。

結論：不同碰撞電壓，目標組分的響應差異不大，最終確定CE電壓為13V。

條件五、對照品溶液配制方式的選擇

采用加標回收率的考察方式，評估基質效應的影響，數據如下：

結論：根據上述結果可知，本方法測試具有基質效應，標準中擬定采用標準加入法。

四、方法預驗證

對某原料中該雜質進行預驗證，結果顯示，本方法的專屬性良好，靈敏度可以達到0.5ppm的定量，回收率在80%-120%之間，方法可行。

五、參考文獻

[1]2020版《中國藥典》通則 9101.

[2]ICHM7.

[3]衍生化法測定酰胺類基因毒警示結構雜質的綜述.