我們的色譜柱可以有金剛不壞之身而永久服役嗎？我們都知道這是不可能的，但是倒有方法可以預防色譜柱使用壽命過短。

我們會不會覺得實驗室的經費好像都在用來買色譜柱了？我們是否會想為什么色譜廠家不能生產壽命更長的色譜柱呢？實際上，如果在使用過程中有適當的保護，購買色譜柱的費用只占色譜分析總費用中非常小的部分。一般色譜柱正常使用的壽命大概500-1000針左右，如果以這個數字來計算，色譜柱所占有的費用大概是整個分析費用的1-2%而已。所以就算是我們覺得色譜柱的單價很高，想努力增加額外的保護以增加其壽命，其實對整體分析而言也無法省下太多費用。我的觀點是，如果一支色譜柱能有500針的進樣，就可以算是完成它的使命了。在一般情況下，對色譜柱壽命的合理期望是什么樣的呢？又有哪些保護措施可以延長色譜柱使用壽命？

什么是對色譜柱的壽命的合理期望呢？

首先看看另外一位色譜學家Ron Majors的發現。在他發表的文章中，他對色譜柱的壽命做了一些調研。圖1是他在文章中對2011年調研得到的數據，我們可以看到有將近3/4的受調研者可以得到至少500針的進樣次數（24% + 47% = 71%），而將近一半的可以得到至少1000針的進樣次數（47%）。這是很令人驚訝的結果，因為這個調研包括了各種不同類型的色譜柱，而不只是針對一般比較常用和耐用的150 mm × 4.6 mm規格、粒徑為5 μm的反相色譜柱。                                             

圖1 2011年每支色譜柱壽命結束前的進樣量調研結果

再來看看由1997 到2011年之間又有何變化（圖2），這圖表有幾點值得一提：

（1）   進樣量少于1000針（綠色）的比例由1997年的76%逐年降到2011年的53%；

（2）   進樣量超過1000針（紫色）的比例則逐年上升；

（3）   進樣量500針以內（棕色）的比例由1997的50%左右減少到2011年的25%左右；

（4）   進樣量100針以下（藍色）的不良結果在那么多年來大概就保持10%左右。

圖2  1997-2011年色譜柱壽命結束前進樣量的比較

對這些結果我做了以下大膽的推測：首先我不認為色譜柱壽命增加主要是因為色譜廠家生產技術進步，因為在1997年以后（本文調研開始），裝填色譜柱的技術已經算是很成熟了。所以我認為壽命增長的主要原因是實驗室人員在色譜柱的使用上得到了更好的教育和訓練，也就是說實驗室人員了解如何前處理樣品和知道如何保護色譜柱。而我懷疑那些進樣量少于100針的主要原因是不恰當的操作，而不是色譜柱的問題。這篇文章將針對如何保護色譜柱提出一些建議。

絕對不要進樣“垃圾”

我經常開玩笑說，要保護色譜柱以得到最長壽命的方法就是不要開封色譜柱。一旦開始使用，色譜柱的壽命就逐漸衰減一直到用壞為止。而影響色譜柱壽命的兩個主要因素是樣品中的雜質和顆粒，因此如果我們能夠在進樣前去除樣品中的雜質和顆粒，色譜柱的壽命一定會延長。前處理的方法包括固相萃取（SPE），液液萃取和其他的過濾方法。簡單地說，如果在樣品進入色譜柱前能大量減少其中的污染物，色譜柱的壽命一定會延長，但是同時我們也必須考慮花在前處理的時間和費用是否能得到合理的回報。如果目前使用的色譜柱已經達到500針的進樣量，而使用前處理所增加的時間和費用，如果需要將色譜柱的壽命由進樣500針增加到2500針才劃得來的話，就必須好好考慮是否前處理有其經濟效益。但是如果進血漿樣品，不經過前處理，可能不到10針柱子就廢了，這時候前處理就非常有必要了。但是除了經濟效益以外，對于使不使用前處理，對色譜數據的優劣也必須做一個比較。在我們實驗室中，這些前處理往往能夠讓我們即使在更低的濃度下也能收集到有效的數據，也能讓我們得到更一致的結果。

不管有沒有使用前處理，建議所有的樣品在進樣前經過過濾或是離心處理。例如當樣品經過濾膜可以濾除顆粒從而減少堵塞色譜柱的篩板，濾膜的孔隙大小必須小于色譜柱的篩板孔徑大小。一般大于3 μm顆粒的色譜柱使用2 μm大小的篩板，3 μm顆粒的色譜柱則使用0.5 μm的篩板，而小于3 μm顆粒的色譜柱一般使用0.2 μm的篩板，因此最通用的0.45 μm的濾膜基本可以用在除了亞2 μm顆粒以外所有的色譜柱；對于亞2 μm顆粒的色譜柱，一般使用0.2 μm大小孔隙的濾膜。大多濾膜是事先封裝好，可以直接接在注射器進行過濾或是作為96孔板的過濾板。

雖然使用濾膜是有效果，但是建議首先考量以下四點：

（1）濾膜并不便宜，雖然每一片的單價并不是很貴，但是加起來的費用就不便宜了；

（2）過濾會花費額外的時間，使用0.5 μm濾膜過濾很慢，而使用0.2 μm濾膜就更慢了；

（3）嚴格地講，一旦過濾一個樣品，對其他樣品，不管有沒有必要過濾，都得過濾，以免出現不必要的變量干擾實驗數據；

（4）一旦使用過濾，對方法開發進行驗證時，也必須驗證過濾程序。由于過濾過程往往會損失樣品，因此我們需要確定是否存在不同成分損失程度不一致的情況，特別在高濃度和低濃度的時候。

由于使用濾膜是費時費錢的工作，因此每個實驗室要先做評估是否值得。但是不可否認，使用濾膜過濾樣品在絕大多數的情形下是可以增長色譜柱的壽命。

另外可以取代或是補充濾膜過濾的方法就是進樣前使用離心處理樣品。這是簡單又經濟的方法。離心后，一些容易堵塞篩板的大顆粒會沉淀在離心管底部，然后可以很簡單取樣進行分析。多年來我們一直使用這種方法在蛋白樣品的分析，幾乎沒有發生過因為顆粒堵塞色譜柱的問題。我曾經有過在使用UHPLC時，雖然樣品經過0.2 μm的濾膜過濾但是還是有些渾濁，進這種樣品而造成色譜柱堵塞的經歷，但是一旦渾濁的樣品經過離心后，取不再渾濁的樣品進樣，色譜柱堵塞的問題也解決了。

使用在線過濾器

我深信在線過濾器是HPLC或UHPLC儀器上最有經濟效益的部件。在線過濾器放置在自動進樣器和色譜柱（或是保護柱）之間，常用的在線過濾器分為含有可替換篩板（0.5 μm或0.2 μm）的不銹鋼在線過濾器以及一次性的PEEK材質的在線過濾器，一般必須選擇比柱篩板孔徑更小的篩板，這樣才能有效攔截可能堵塞色譜柱篩板的顆粒。一旦發現儀器的壓力開始增加，可能在線過濾器篩板開始堵塞了，我們必須在其被完全堵塞前更新。

在線過濾器的功能就如同使用濾膜一樣，但是不需要任何額外的工作。使用離心機處理樣品后，還是有可能會有少許的顆粒進入儀器，而位在色譜柱前面的在線濾器就可以將殘留顆粒攔截下來。此外在線濾器的好處是簡單易換，一般只需要5分鐘就可以換好，就可以重新開機使用，也不需要花時間重新調節或是校正。另外一個好處就是在線過濾器也可以過濾掉儀器中一些零配件老化耗損所產生的顆粒。我是非常的主張每臺液相儀器都裝配在線過濾器，即使使用保護柱，我也建議在保護柱前加裝在線過濾器。

使用保護柱

保護柱可以簡單的說是裝在色譜柱前面的一支短的色譜柱。一般是1-2 cm長，裝的填料和使用的色譜柱填料相匹配，而使用的篩板孔徑不會比色譜柱中使用的篩板孔徑大。保護柱有兩種功能：（1）可以阻擋可能堵塞色譜柱的顆粒；（2）因為保護柱和色譜柱填料相匹配，任何可能和色譜柱填料產生不可逆作用而不出峰的化學雜質，會被保護柱先行捕獲。

使用保護柱絕對可以延長色譜柱的壽命。但是考慮是否使用保護柱前，建議評估以下幾點：

（1）保護柱也不便宜，所以要考慮購買保護柱的費用是否能由所增加的色譜柱壽命補償回來；

（2）保護柱的壽命有多長？必須注意何時需要換保護柱芯，不要因為更換太晚而污染到色譜柱；

（3）如何沖洗保護柱？沖洗時需要將保護柱和色譜柱分開沖洗，以免將累積在保護柱內的不純物沖洗到色譜柱中；

（4）不要期望因為加了1-2 cm的保護柱而會增加柱效。裝上保護柱雖然類似增加柱長，但是使用保護柱也增加了兩個接頭和連接管路，這些會造成儀器系統柱效減少，因此如果能維持不裝保護柱時的柱效就不錯了。

毋庸贅言，使用保護柱肯定可以延長色譜柱的壽命，但是建議每個實驗室在經濟效益和工作量方面來評估是否需要使用保護柱。即使使用保護柱，我也會建議在保護柱和自動進樣器之間裝個在線濾器，畢竟更換在線濾器比更換保護柱便宜，也可以同時增加保護柱和色譜柱的壽命。

總結：雖然色譜柱不可能永遠不壞，但是我們可以采納一些簡單的方法來延長色譜柱的壽命。首先，即使樣品需要前處理，建議最后一步可以再使用過濾或是離心進一步處理樣品；其次，使用在線濾器或是保護柱來保護色譜柱，可以攔截樣品中或是儀器本身產生的顆粒；第三，根據自己的分析物來評估是否值得使用保護柱；最后，記得在每一次分析結束后，使用強溶劑將被色譜柱保留的雜質沖洗出來。

參考文獻

（1）John W. Dolan, LCGC North America, 32 (12), 916 - 920(2014)

（2）R.E. Majors, LCGC North America, 30(1),20–34 (2012).