摘要　目的：研究注射用醋酸奧曲肽微球體外釋放度加速試驗(yàn)方法，并探討與體內(nèi)釋放的相關(guān)性，為該制劑的有效性評(píng)價(jià)研究提供參考。方法：分別采用轉(zhuǎn)瓶法和流池法考察了溫度、pH、轉(zhuǎn)速、流速、樣品池的種類、膜的排列方式、玻璃珠以及加樣方式等影響因素，建立了體外加速釋放在溫度 37 ℃、片劑池（22.6 mm）、流速 16 mL·min-1 和 pH 10.0 緩沖液中進(jìn)行的流池法，并與在溫度 37 ℃、轉(zhuǎn)速 6 r·min-1 和 pH 10.0 緩沖液中進(jìn)行的轉(zhuǎn)瓶法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果：注射用醋酸奧曲肽微球在流池法中的釋放均快于轉(zhuǎn)瓶法中的釋放；且 2 種制劑樣品不同方法測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致，制劑 A 釋放快于制劑 B；對(duì)流池法體外加速釋放 - 體內(nèi)釋放進(jìn)行線性回歸，制劑 A 和 B 相關(guān)系數(shù) r 分別為 0.998 2、0.960 9。結(jié)論：采用流池法測(cè)定的體外加速釋放快于轉(zhuǎn)瓶法，且與體內(nèi)釋放具有良好的相關(guān)性（r>0.9），為評(píng)價(jià)奧曲肽微球制劑的體內(nèi)外釋放提供參考。

 

注射用醋酸奧曲肽微球臨床主要用于治療肢端肥大癥等疾病，肌肉注射給藥，給藥周期為 28d［1］。該微球制劑由諾華制藥原研，于 2003 年在我國獲批上市，目前國內(nèi)尚未有仿制制劑上市。奧曲肽微球［2］在處方和工藝上均與亮丙瑞林［3］等其他多肽微球注射劑不同，采用葡萄糖星型丙交酯和乙交酯共聚物作為生物可降解緩釋輔料，采用相分離法制備微球，其質(zhì)量控制與藥學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)方法面臨挑戰(zhàn)。釋放度是評(píng)價(jià)緩釋微球制劑的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)，體外釋放試驗(yàn)一般分為突釋釋放、加速釋放和常速釋放。針對(duì)注射用醋酸奧曲肽微球的體外釋放度，F(xiàn)DA 溶出度數(shù)據(jù)庫［4］推薦采用流池法、槳法等裝置進(jìn)行研究；文獻(xiàn)［5］建立了常速釋放轉(zhuǎn)瓶測(cè)定法，試驗(yàn)周期為 36d，重點(diǎn)對(duì)突釋階段進(jìn)行了研究；尚未見體外加速試驗(yàn)方面的研究報(bào)道。為提高注射用微球制劑質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)的效率，有必要對(duì)該制劑的體外加速釋放度試驗(yàn)方法進(jìn)行研究。

 

文獻(xiàn)報(bào)道［6-12］注射用微球制劑的體外釋放度方法有直接釋藥法、透析膜擴(kuò)散法、流池法等，各有特點(diǎn)。采用水浴轉(zhuǎn)瓶裝置的直接釋藥法，雖然操作簡(jiǎn)便，但微球易聚集或浮動(dòng)，且在進(jìn)行分離時(shí)樣品容易損失，對(duì)最終試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。流池法即美國藥典溶出度測(cè)定第Ⅳ法［13］，包括開環(huán)和閉環(huán) 2 種模式，將微球置于樣品池中，釋放介質(zhì)往復(fù)通過樣品池中的微球，定時(shí)取樣并補(bǔ)充相應(yīng)的釋放介質(zhì)。此方法因能更好的模擬人體內(nèi)環(huán)境，生物相關(guān)性良好，被美國 FDA推薦作為測(cè)定 PLGA 微球釋放度的最適方法［14］，但其成本過高，且存在反壓力和過濾器堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。

 

本文通過考察溫度、流速、pH、樣品池、樣品裝填方式等條件，建立了流池法測(cè)定注射用醋酸奧曲肽微球體外加速釋放度，并與轉(zhuǎn)瓶法進(jìn)行對(duì)比研究，同時(shí)采用 LC-MS 法測(cè)定大鼠血漿中奧曲肽的濃度，探討分析體外加速釋放和體內(nèi)釋放行為，為醋酸奧曲肽微球注射劑的有效性評(píng)價(jià)研究提供參考。

 

1　材料與方法

 

1.1 儀器與試藥

 

儀器：Agilent 1260 高 效 液 相 色 譜 儀、Agilent 1290 高效液相色譜（Agilent 公司）；QTRAP 5500MS/MS 系 統(tǒng)（Agilent 公 司）；轉(zhuǎn) 瓶 裝 置（Rotating Bottle Apparatus，Agilent 公司）；CE-7 流通池（Sotax 公司）；ZKT-7F 真空脫氣儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；Fresco 21 XIR 臺(tái) 式 離 心 機(jī)（ThermoHeraeus 公司）；VORTEX 多功能漩渦混合器（Scientific 公司）；Turbo Vap 蒸發(fā)儀（Biotage 公司）。

 

試藥：醋酸奧曲肽對(duì)照品（批號(hào) 140730-201303，含 量 87.6%，中 國 食 品 藥 品 檢 定 研 究 院）；13C6-Lys Octreotide Tri（TRC 公司）；注射用醋酸奧曲肽微球和溶媒樣品（生產(chǎn)企業(yè) A、生產(chǎn)企業(yè) B）；濾膜（GF/F：0.7 μm，批號(hào) 9565828，GF/D：2.7 μm，批號(hào) 9739611，Whatman 公司）；濾頭（2 μm；Upchurch 公司）；固相萃取柱（Oasis WCX 1 cc/30 mg，30 µm，WATERS OASIS 公司）。

 

試 劑：甲 醇（批 號(hào) SB6SF66072；MERCK 公 司）、甲 酸（批 號(hào) 402907，F(xiàn)LUKA 公 司）；丙 酸（批 號(hào)SHBC7498V，F(xiàn)LUKA 公 司）；磷 酸（≥ 85.0%）、冰醋 酸（≥ 99.5%）、三 水 乙 酸 鈉（≥ 99.0%）、氯 化 鈉（≥ 99.5%）、氯化銨（≥ 99.5%）均來源國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四甲基氫氧化銨五水合物（97%，北京百靈威科技有限公司）；乙腈（99%，F(xiàn)isher Scientific公 司）；十 二 烷 基 硫 酸 鈉（批 號(hào) 100809-201302， ≥95%中國食品藥品檢定研究院）。

 

1.2 體外釋放度測(cè)定-轉(zhuǎn)瓶法

 

1.2.1 試液配制

 

緩沖液（pH 4.0）：稱取 0.9 g 冰醋酸，用 250 mL 水溶解，用 5 mol·L-1 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 4.0。加入 5.25 g 十二烷基硫酸鈉，慢慢攪拌使溶解。緩沖液（pH 7.0）：稱取 1.35 g 氯化銨至 250 mL 量瓶，用水溶解后用三乙胺調(diào)節(jié) pH 為 7.0±0.1。加入 5.25 g 十二烷基硫酸鈉，慢慢攪拌使溶解。緩沖液（pH 10）：稱取 2.7 g 氯化銨至 500 mL 量瓶，用 450 mL 水溶解，量取 6.0 mL 三乙胺加入瓶中，混勻，用水定容至刻度。用三乙胺調(diào)節(jié) pH 為 10.0±0.1，加入10.5 g 十二烷基硫酸鈉，慢慢攪拌使溶解。

 

供試品溶液：取適量微球，置 40 mL 轉(zhuǎn)瓶中，加入 30 mL 緩沖液，擰緊瓶蓋，立即將轉(zhuǎn)瓶與裝置連接并開始旋轉(zhuǎn)。在 1、4、24 h 從裝置上移除轉(zhuǎn)瓶，取出500 μL，過濾，將 300 μL 濾液倒回轉(zhuǎn)瓶中，將剩下的200 μL 濾液置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。

 

1.2.2 實(shí) 驗(yàn) 裝 置

 

水 浴 轉(zhuǎn) 瓶 裝 置（Rotating Bottle Apparatus，Agilent 公司）

 

1.3 體外釋放度測(cè)定——流池法

 

1.3.1 試液配制

 

緩沖液（pH 4、7、10）：同“1.2”項(xiàng)下方法。

供試品溶液：取適量微球，置樣品池中，加入 60 mL 緩沖液于瓶中。在 1、4、8、12、24、36、48 h 時(shí)取出 500 μL 等分部分，過濾，將 300 μL 濾液倒回瓶中，將剩下的 200 μL 濾液置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。

 

1.3.2 實(shí)驗(yàn)裝置

 

采用美國藥典溶出度測(cè)定第Ⅳ法 - 流池法裝置［13］。

 

1.4 HPLC 條件

 

色譜柱：Brownlee NEW GUARD，RP-18，Aquapor， （7 μm，3 mm×15 mm），Brownlee Spheri-5，RP-18（5 μm，4.6 mm×100 mm）；流動(dòng)相：水 - 乙腈 - 四甲基氫氧化銨溶液（1 200∶600∶200）；流速：1.2 mL·min-1；檢測(cè)器 DAD；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣器溫度：8 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；等度洗脫。

 

1.5 體內(nèi)釋放測(cè)定

 

1.5.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

 

供試品溶液制備：分別精密稱取微球樣品（生產(chǎn)廠 A 和 B）適量，加入溶媒 5 mL，配制成質(zhì)量濃度約為 2 mg·mL-1 混懸液。

 

動(dòng)物與給藥：取 18 只雄性成年鼠，體重為 200~ 250 g，均分為 3 組，分別為 A 組、B 組、空白組，每組6 只。按給藥體積為 1.0 mL·kg-1，對(duì) A 組、B 組分別肌肉注射給藥樣品 A、B 混懸液，各組應(yīng)在 5 min 之內(nèi)完成給藥，避免懸浮液中沉淀生成。

 

樣品的采集與儲(chǔ)存：于 0、0.25、0.5、1、2、6 h 和 1、 2、3、4、7、9、11、13、15、18、21、25、28、32、35、42、49、56 d 從 SD 大鼠的眼眶后靜脈叢采血 0.5 mL，將血液加入預(yù)置 5 µL 濃度為 50 TIU·mL-1 的抑肽酶和5 µL 肝素的抗吸附 EP 管中（冰盒上），混勻。4 ℃下，12 000 r·min-1 離心 10 min，取上清液至另一抗吸附 EP 管中，-80 ℃保存待測(cè)。

 

1.5.2 樣品前處理

 

精密移取大鼠空白血漿 100 µL，加稀釋液（甲醇 - 水 - 甲酸（60∶40∶0.2）100 µL，內(nèi)標(biāo)（13C 6Octretide 20 ng·mL-1）100 µL，于 1.5 mL 離心管中，加入 4% 磷酸水溶液 100 µL，混勻；活化固相萃取柱；將樣品加于固相萃取柱中后離心，先后加洗滌液，離心洗去雜質(zhì)，再加入洗脫液洗脫樣品，離心（1 000 r·min-1，2 min）用玻璃管收集洗脫液；洗脫液置于 50 ℃水浴，N2 吹干后，用 100 µL 稀釋液溶解后進(jìn)樣至液相色譜質(zhì)譜儀。

 

1.5.3 LC-MS 分 析 法

 

色 譜 條 件：色 譜 柱 Eclipse plus RRHD C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相甲醇（A）-0.02% 丙酸水溶液（B），流速 0.5 mL·min-1，柱溫 45℃，進(jìn)樣體積 10 μL，梯度洗脫（見表 1）。

 

 

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧離子化源，正電子方式檢測(cè)；溫度 500 ℃ ；氣簾氣體（CUR，N2）壓力0.2 MPa；離子噴射電壓 5 000 V；源內(nèi)氣體 1（GS1， N2）壓 力 0.4 MPa；源 內(nèi) 氣 體 1（GS2，N2）壓 力0.4 MPa；掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；

 

奧曲肽 m/z510.4>120.1；去簇電壓（DP）120 V；碰撞能量（CE），25 V；內(nèi) 標(biāo) 13C6Octretide m/z 513.5>120.1；去 簇 電 壓（DP）100 V；碰撞能量（CE）：25 V

 

2　結(jié)果

 

2.1 體外加速釋放實(shí)驗(yàn)影響因素考察

 

2.1.1 轉(zhuǎn)瓶實(shí)驗(yàn)法影響因素

 

轉(zhuǎn)瓶法實(shí)驗(yàn)按照表 2設(shè)計(jì)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)因素考察結(jié)果見圖 1。溫度：如圖 1-a所示，4 h 內(nèi)微球在 45℃、55℃條件下釋放較慢，推測(cè)是由于高溫使聚合物 PLGA 發(fā)生形態(tài)變化，閉合了表面孔隙從而減少了藥物的擴(kuò)散；4 h 后在 55 ℃時(shí)條件下微球中藥物釋放突增，推測(cè)是由于更高的溫度加快了聚合物的溶蝕作用，這與文獻(xiàn)［6-12］報(bào)道相一致；在 37℃下釋放平穩(wěn)且 24 h 釋放量超過 60%。綜合考慮，最終選擇 37℃作為體外加速釋放試驗(yàn)的溫度。

 

轉(zhuǎn)速：由圖 1-b 可見，轉(zhuǎn)瓶法轉(zhuǎn)速 24 r·min-1 以內(nèi)，轉(zhuǎn)速增加釋放增多，轉(zhuǎn)速超過 24 r·min-1 釋放并未繼續(xù)增加。

 

釋放介質(zhì)：如圖 1-c 所示，pH 4.0、pH 7.0 條件下24 h 內(nèi)基本不釋放，pH 10 條件下 24 h 內(nèi)釋放量超過60%。根據(jù)酸堿催化理論［4］，大量的氫離子或氫氧根離子都會(huì)誘導(dǎo) PLGA 內(nèi)酯鍵裂解，從而達(dá)到加速釋放的目的。

 

轉(zhuǎn)瓶法體外加速釋放條件最后選擇為溫度37℃、轉(zhuǎn)速 6 r·min-1、pH 10 釋放介質(zhì)。

 

 

2.1.2 流通池實(shí)驗(yàn)法影響因素

 

在轉(zhuǎn)瓶法實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，利用流通池對(duì)玻璃珠及樣品裝填方式、粉體池濾膜、樣品池、樣品濃度、流速等條件進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)按照表 3 設(shè)計(jì)進(jìn)行。

 

樣品量：由圖 2-a 可見，含 3.10 mg·mL-1 奧曲肽的混懸液釋放最快。

 

玻璃珠體積及樣品裝填方式：由圖 2-b 可見，玻璃珠體積、溶媒的加入對(duì)微球釋放的影響較小，加樣前后均加入玻璃珠釋放較快。

 

粉體池中過濾膜：膜的典型排列方式如圖 3，由圖 2-c 結(jié)果可見，膜的排列方式對(duì)釋放的影響不大。

 

樣 品 池：由 圖 2-d 可 見，使 用 片 劑 大 池（22.6 mm）、片劑小池（12 mm）、粉體池的釋放度依次遞減，這可能是由于片劑小池（12 mm）和粉體池的體積較小，微球中 PLGA 溶脹后易堵住過濾器而造成的。

 

流速：從圖 2-e 可知，流速增加釋放度增大。

 

 

流池法最后選擇的條件為溫度 37 ℃、片劑大池、流速 16 mL·min-1、pH 10 釋放介質(zhì)。

 

2.2 體外加速釋放度測(cè)定

 

本研究通過改變溫度、pH、轉(zhuǎn)速 / 流速等條件加速了藥物從 PLGA 微球中釋放，最終建立了流池法體外加速釋放測(cè)定方法，分別測(cè)定不同企業(yè)微球樣品，并與轉(zhuǎn)瓶法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。由表 4 可見，2 種方法測(cè)定的體外加速釋放度，4 h 后樣品 A 的釋放度均大于樣品 B，且采用流池法測(cè)定體外釋放度，樣品 A 和 B的釋放度均明顯大于轉(zhuǎn)瓶法。

 

 

2.3 體內(nèi)釋放測(cè)定

 

微球經(jīng)皮下或肌肉注射給藥后，藥物從微球中釋放后通過皮下或骨骼肌的結(jié)締組織擴(kuò)散，再經(jīng)毛細(xì)血管吸收進(jìn)入血液循環(huán)分布到靶器官發(fā)揮藥效［16］。本文利用大鼠對(duì) 2 家企業(yè)的醋酸奧曲肽微球進(jìn)行體內(nèi)釋放試驗(yàn)，通過 LC-MS 檢測(cè)大鼠體內(nèi)奧曲肽血藥濃度，研究該微球制劑藥物的體內(nèi)釋放行為。A、B 2 組大鼠血漿中奧曲肽濃度測(cè)定結(jié)果見圖 4 。

 

 

3　討論

 

3.1 體外加速釋放測(cè)定方法

 

對(duì)比 2 種體外加速釋放測(cè)定方法，轉(zhuǎn)瓶法的操作更為簡(jiǎn)單，但需注意取樣時(shí)勿粘取微球造成損失，導(dǎo)致釋放結(jié)果偏低；流通池法需要選擇合適的樣品池，避免微球溶脹，池內(nèi)壓力過大，導(dǎo)致釋放結(jié)果不準(zhǔn)確。微球樣品在流池法條件下的釋放速率快于轉(zhuǎn)瓶法，針對(duì)釋放機(jī)制為擴(kuò)散和溶蝕作用的微球而言，流池法更為適合作為體外加速釋放的測(cè)定方法。

 

3.2 體內(nèi)釋放曲線和數(shù)學(xué)模型

 

將大鼠體內(nèi)釋放數(shù)據(jù)與流池法體外加速釋放數(shù)據(jù)利用 Origin Pro 8.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。根據(jù)D’Souza S 等［9］。的研究，體內(nèi)釋放度可以利用曲線下面積的百分?jǐn)?shù)所表示，圖 5 為微球樣品 A、B 的體內(nèi)釋放曲線。

 

 

對(duì)體內(nèi)釋放數(shù)據(jù)利用 Origin Pro 8.0 軟件中的Boltzmann、Logistic 等數(shù)學(xué)模型擬合曲線。Boltzmann 方程：y=A2+（A1-A2）（/ 1+exp（x-x0/dx））見圖 6 Boltzmann曲 線；Logistic 方 程：y=A2+（A1- A2）/（1+（x/x0）p）見 圖 7 Logistic 曲線。

 

 

 

3.3 體內(nèi)外釋放度分析

 

本文結(jié)合體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，對(duì)體內(nèi)與體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探索體外加速釋放 - 體內(nèi)釋放的相關(guān)性。由表 5 和圖 8-10 可見，體外加速釋放（流池法）線性擬合后，與將體內(nèi)釋放擬合曲線對(duì)應(yīng)的點(diǎn)利用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。微球樣品 A、B 體外加速釋放線性擬合曲線的決定系數(shù) r2 分別為 0.987 3、0.927 5；對(duì)體外加速釋放 - 體內(nèi)釋放進(jìn)行線性回歸相關(guān)性分析，樣品 A、B 回歸直線的相關(guān)系數(shù) r 分別為0.998 2、0.960 9。

 

 

結(jié)果表明，采用流池法測(cè)定體外加速釋放度，微球樣品 A 和樣品 B 的體外釋放與體內(nèi)釋放均具有良好的相關(guān)性。

 

4　小結(jié)

 

本文以注射用醋酸奧曲肽微球?yàn)檠芯繉?duì)象，進(jìn)行了體外釋放度測(cè)定方法研究和體內(nèi)外釋放相關(guān)性初步研究。通過體外加速釋放試驗(yàn)方法研究，探索了影響奧曲肽微球釋放的因素，如溫度、pH、轉(zhuǎn)速、流速、樣品池的種類、膜的排列方式、玻璃珠以及樣品裝填方式等。建立了流池法測(cè)定奧曲肽微球制劑的釋放度，并比較了與轉(zhuǎn)瓶法的適用性。通過體內(nèi)外釋放相關(guān)性的探索性研究，建立了體內(nèi)釋放、體外加速釋放的擬合曲線，結(jié)果表明體外加速釋放與體內(nèi)釋放呈線性相關(guān)。本文建立的體外加速釋放流通池測(cè)定方法對(duì)于不同微球樣品有較好的區(qū)分力和良好的體內(nèi)外線性相關(guān)，可用于注射液醋酸奧曲肽微球的質(zhì)量控制，與 FDA 推薦的 PLGA 緩釋微球體外釋放分析策略一致，本研究為評(píng)價(jià)奧曲肽微球制劑的體外釋放度提供了新的測(cè)定方法，為深入開展肽類緩釋注射劑體內(nèi)藥代參數(shù)的預(yù)測(cè)研究積累了技術(shù)數(shù)據(jù)。