隨著分子生物學研究逐步普及,凝膠成像系統在國內的需求在不斷增長不管是什么用途,凝膠成像系統的組件都是相似的：拍攝系統、帶有特殊光源的暗箱、獲取和分析凝膠圖片的軟件。

 

大部分凝膠成像系統提供了不同的產品特性來滿足不同科學研究的需要快速發展的電子技術、光學技術和成像分析軟件使成像操作越趨人性化。

 

原理及應用

 

凝膠成像系統是一個集觀察、拍攝和分析凝膠于一體的凝膠分析系統。使用該系統可以對凝膠進行定量和定性分析。

凝膠成像系統是實驗室常用的一種儀器,其應用范圍極其廣泛。總的來說,凝膠成像系統可以用于:蛋白質、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分離純化結果作定性分析;確定生物分子的分子量;用于生物分子的定量分析。

 

樣品在電泳凝膠或者其他載體上的遷移率不一樣,以標準品或者其他的替代標準品相比較就會對未知樣品作一個定性分析。這個就是圖像分析系統定性的基礎。根據未知樣品在圖譜中的位置可以對其作定性分析,就可以確定它的成份和性質。 

 

樣品對投射或者反射光有部分的吸收,從而照相所得到的圖像上面的樣品條帶的光密度就會有差異。光密度于樣品的濃度或者質量成線性關系。根據未知樣品的光密度,通過于已知濃度的樣品條帶的光密度指相比較就可以得到未知樣品的濃度或者質量。這就是圖像分析系統定量的基礎。采用最新技術的紫外透射光源和白光透射光源使光的分布更加均勻,最大限度的消除了光密度不均造成的對結果的影響。

 

凝膠成像系統具體可以用于哪些實驗分析?

 

具體從使用分析的角度來看,凝膠成像系統可以應用于分子量計算,密度掃描,密度定量,PCR定量等生物工程常規研究。

 

1、分子量定量

對于一般常用的DNA膠片,利用分子量定量功能,通過對膠上DNA Marker條帶的已知分子量注釋,自動生成擬合曲線,并以它衡量得到未知條帶的分子量。通過這種方法所得到的結果較肉眼觀察估計要準確很多。此方法也適用于對PAGE蛋白膠條帶的分子量測定。

 

2、密度定量

一般常用的測定DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)濃度的方法是紫外吸收法,但它只能測定樣品中的總核苷酸濃度,而不能區分各個長度片段的濃度。利用凝膠成像系統和軟件,先將DNA膠片上某一已知其DNA含量的標準條帶進行密度標定以后,可以方便的單擊其他未知條帶,根據與已知條帶的密度做比較,可以得到未知DNA的含量。此方法也適用于對PAGE蛋白膠條帶的濃度測定。

 

3、密度掃描  

在分子生物學和生物工程研究中,常用到的是對蛋白表達產物占整個菌體蛋白的百分含量的計算。傳統的方法是利用專用的密度掃描,但利用生物分析軟件,結合白光照射的凝膠成像獲取圖片,就能完成此項工作。 

 

4、PCR定量 

PCR定量主要是指,如果PCR實驗擴增出來的條帶不是一條,那么可以利用軟件計算出各個條帶占總體條帶的相對百分數。就此功能而言,與密度掃描類似,但實際在原理上并不相同。PCR定量是對選定的幾條帶進行相對密度定量并計算其占總和的百分數,密度掃描時對選擇區域生成縱向掃描曲線圖并積分。

 

說說分類

 

1、普通凝膠成像分析系統

適用于對蛋白凝膠電泳(考馬斯染色,銀染)等可見光樣品,以及DNA/RNA(EB、TLC plates、SYBR Green)等紫外;進行圖象采集并進行定性和定量分析;

 

2、化學發光成像分析系統

適用于化學發光/紫外光/可見光凝膠成像分析系統,如ECL、ECL PLUS、Southern、CDP Star、CSPD、Northern和Western雜交的化學發光等各種化學發光暴光后的樣品檢測

 

3、多色熒光成像分析系統

適用于熒光/化學發光/可見光凝膠成像分析系統,如:EB 、TLC plates、GFP plates、SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、Sypro Red、Sypro Orange、Texas Red、Rhodamine Red、Fluorescein、Deep Purple、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、熒光板等的樣品檢測;

 

4、多功能活體成像分析系統

適用于生物發光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術。生物發光是用熒光素酶(luciferase)基因標記細胞或DNA,而熒光技術則采用熒光報告基團(GFP、RFP),或 Cyt及dyes等熒光染料進行標記。

 

凝膠成像系統有哪些結構？

 

凝膠成像系統的基本骨架包含:CCD相機,暗室和分析軟件。其不僅對瓊脂糖凝膠進行成像,還適用于蛋白膠、發熒光的膠、印跡膜和菌落平板等應用。在Western Blot方面,高性能的CCD分子成像系統能與膠片媲美。

 

1、CCD

CCD是電荷耦合器件(Charge Coupled Device)的英文名稱縮寫,是一種光電轉換器件,是凝膠圖像系統的核心部件。有人把數碼相機的像素看得很重,但比較之后發現,有些400萬、500萬像素的相機拍出來的片子沒有300像素的機子拍出來的好,這是為什么?

圖片

衡量CCD好壞的指標,有分辨率,CCD尺寸,動態范圍,靈敏度,量子效率,信噪比等,其中像素數以及CCD尺寸是重要的指標。CCD感光器件的面積越大,捕獲的光子越多,感光性能越好,信噪比越低。

 

（1）CCD尺寸

為了方便您更了解CCD的大小,現列舉目前市場上所應用的CCD規格如下:

1英寸  ——靶面尺寸為寬12.7mm*高9.6mm,對角線16mm。

2/3英寸——靶面尺寸為寬8.8mm*高6.6mm,對角線11mm。

1/2英寸——靶面尺寸為寬6.4mm*高4.8mm,對角線8mm。

1/3英寸——靶面尺寸為寬4.8mm*高3.6mm,對角線6mm。

1/4英寸——靶面尺寸為寬3.2mm*高2.4mm,對角線4mm。

CCD的分辨率由低到高:從45萬左右,100萬左右,140萬左右,200萬左右,300萬左右,400萬左右,500萬左右,甚至還有更高的,根據CCD的溫度有可以分為常溫CCD相機和制冷CCD相機,制冷CCD:熱或者暗電流對于CCD都是噪音,噪音在冷CCD基本都可以被深度致冷的Peltier消除。在曝光超過5-10秒,CCD芯片就會發熱,沒有致冷設備的芯片,“熱”或者白的像素點就會遮蓋圖像,圖像到處可見雪花。CCD結構設計、數字化的方法等都會影響噪音的產生。當然通過改善結構、優化方法,同樣能減少噪音的產生。

 

制冷CCD的適用性:熒光及化學發光本身較弱,所以對CCD噪音的降低要求很高,應選用高分辨率數字冷卻CCD相機結合高通透鏡頭系統,使其能夠捕獲到信號極其微弱的熒光及化學發光樣品圖像,并且能夠最大程度的降低噪音,減少背景,提供出色的圖像清晰度。另外可選激發光源及多位濾鏡輪擴大了熒光/化學發光成像的應用范圍。所以一般在熒光及化學發光觀察時需要選擇制冷CCD。所以制冷CCD相機絕對是高端分子影像成像分析系統的未來的發展趨勢和必須要求。

 

（2）分辨率

分辨率的大小和像素值是分不開的,像素指得是CCD能分別的最小的感光元件,我們平時說的多少萬像素就是這些感光元件的個數了。所以一般來講像素越多,成像也就越清晰細膩,當然這其中還要受許多因素限制。高像素也不一定是好的CCD,其原因就是像素大小(Pixel Size),也是很重要的因素,相同數目的像素,排列越密集,像素之間就越容易出現電流干擾,容易出現"噪點"等干擾成像質量的現象出現。由于制造工藝的限制,增加尺寸,成本將會以幾何級數提高。

 

現在大部分廠家的CCD為了提高圖像的靈敏度,會使用像素合并的技術,那么像素合并的意義是什么呢?像素合并是一種非常有用的功能,它可被用來提高像素的大小和靈敏度。

 

（3）動態范圍值

動態范圍表示在一個圖像中最亮與最暗的比值?；译A表示在一種表征光亮度的方法,bit值越高能分出的細微差別越大。值得一提的是,目前來說,市場上主流的凝膠成像的CCD以12bit為主,16bit的儀器一般情況下,分辨率均在200萬像素左右,對于真正的16bit,而像素值又近400萬的CCD是非常少見的。對動態范圍進行量化需要一個運算公式,即動態范圍值 = 20 log (well depth/read noise),其中Well depth代表是滿井電子,是CCD飽和時能接受的電子信號總值,read noise是讀出噪聲(以電子數來表示),每個CCD在讀數的過程中都會產生噪聲,噪聲越小,監測靈敏度越高。其中滿井電子與CCD的bit值是相關的,通常下,bit值越高,滿井電子的數值越大。動態范圍的值越高CCD性能越好。

 

（4）量子效率  

CCD的量子效率也稱像素靈敏度,指在一定的曝光量下,像素勢阱中所積累的電荷數與入射到像素表面上的光子數之比。不同結構的CCD其量子效率差異很大。比如100光子中積累到像素勢阱中的電荷數是50個,則量子效率為50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是CCD 的量子效率與入射光的波長有關。

 

（5）信噪比

暗電流是導致CCD噪音的很重要的因素。暗電流指在沒有曝光的情況下,在一定的時間內,CCD傳感器中像素產生的電荷。我們在做化學發光檢測的時候,需要的曝光的時候比較長,這樣導致CCD產生較多的暗電流,對圖像的質量影響非常大。通常情況下通過降低CCD的溫度來最大限度的減少暗電流對成像的影響。暗電流與溫度的關系,CCD產生的暗電流隨著溫度下降而減少,但是在-23℃下曲線開始趨于平緩,由此可以看出溫度并非需要無休止的降低的。所以在選擇冷CCD時,溫度在-25℃下一般就可以達到要求了。

有的CCD是在圖像最終生成后,通過軟件去背景來扣除暗電流,對于信號遠遠強于背景的有一定效果,但是對于弱信號處理過程中會產生越來越多的錯誤。

 

2、光學鏡頭

光學鏡頭是機器視覺系統中必不可少的部件,直接影響成像質量的優劣,影響算法的實現和效果。光學鏡頭規格繁多,有時不免頭暈。光學鏡頭從焦距上可分為短焦鏡頭、中焦鏡頭,長焦鏡頭;從視場大小分有廣角、標準,遠攝鏡頭;結構上分有固定光圈定焦鏡頭,手動光圈定焦鏡頭,自動光圈定焦鏡頭,手動變焦鏡頭、自動變焦鏡頭,自動光圈電動變焦鏡頭,電動三可變(光圈、焦距、聚焦均可變)鏡頭等。

 

3、濾光鏡片(熒光)

 

光源	激發波長	吸收波長	染料
Blue	475nm	537nm	SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Orange、Cy2等
Green	534nm	606nm	SYPRO Red、Cy3等
Red	632nm	609nm	Texas Red、Rhodamine Red 、Cy5等

 

4、數據傳輸

支持的傳輸速率越高越好

軟件功能

凝膠成像儀都是由硬件和軟件所組成,兩者是不可分割的。硬件設備再好,如果不配上好的軟件,也無法發揮它應有的功能。作為凝膠成像系統軟件功能和用途都基本相似,這里我們介紹一下最關注的幾個特點:

 A、軟件的基本功能:可對不同樣品,如條帶,斑點,細菌克隆,芯片,細胞或者活體動物等,進行定性、定量分析,加批注,輸出圖像等操作。

B、圖像采集方式:對于化學發光或多色熒光產品,軟件應具備電影模式,可以進行圖像多禎累計功能來增強線性動態范圍和數據準確度。

C、操作簡便,軟件應具備操作輔助工具,使軟件操作更簡單易用。最好采用三步式泳道及條帶分析可以快速計算蛋白質和核酸的分子量及含量。

D、數據庫功能也是必不可少的,這樣可以檢索、分類或比較所有生成的圖像。可利用不同的顯示算法程序圖像化顯示條帶差異。

E、曝光方式:應采用單一曝光、多重曝光,累計曝光,延時(定時)曝光多種模式可選。

F、記憶功能:軟件能記憶并自動調用成像數據,這樣你不用每次設置就能獲得重復性好的結果。

G、軟件應配備兩套以上,使用單機版,多用戶版或網絡版,用戶可彼此獨立操作,互不干擾,互不混淆。

 

如何選擇凝膠成像儀？

 

1、看參數

當然有DEMO機的,這條可以忽略。我們對比不同廠商的參數時一定要注意只比關鍵的,而對那些無關痛癢的參數則大可以視而不見。

 

對于掃描成像而言,靈敏度一般不是問題,我們關注的應該是分辨率,當然分辨率只要達到我們的要求即可,對于小型的凝膠、膜和微孔板來說,一般分辨率在25um左右應該是足夠了。在滿足分辨率后,一個更重要的參數擺在我們的面前,那就是動態范圍,簡單的說,動態范圍決定著你能否同時在一張膠上同時看到強的信號和弱的信號,而且他們之間保持比較好的定量關系。一般動態范圍采用數量級來表示,這個數越大,表明動態范圍越寬。對于激光掃描成像系統,情況就復雜一些。從激光器、濾光片到分光鏡和檢測器還有好多需要考慮和比較的。

 

下面主要介紹實驗室常用的凝聚成像儀的參數選擇。根據原則一,如果您主要用它來拍普通核酸膠或蛋白膠,那么幾乎市場上所有的成像儀都可以很好的滿足您的需求,這時除了價格這個決定因素外,能比較的也就是一些諸如“操作是否簡便、外形是否時尚”等無關痛癢的指標了。真正需要花心思考察的可能就是準備做化學發光的用戶,他們對敏感度要求高,同時還要求比較寬的動態范圍。

 

要想捕獲到微弱的化學發光,需要上佳的CCD相機和鏡頭。一般來說,CCD相機的冷卻溫度和背景噪音息息相關,溫度越低,噪音就越低。因此,-25℃的制冷溫度是對相機的基本要求(更低的溫度,噪音降低效果不明顯,而量子效率又會受很大影響);另外,較大的像素能夠提供更高的捕光效率;所以對于相同大小的CCD芯片,需要注意像素的尺寸。

 

鏡頭的參數就簡單了,由于我們只需要觀察近距離的樣品而且一般可以調整樣品位置(有些廠家甚至提供電動樣品升降平臺),所以基本無需選擇長鏡頭或者變焦鏡頭;但是,由于我們需要檢測微弱的化學發光,鏡頭的光圈則至關重要,一般F值越小,其通光量越大,而且成平方反比關系,因此我們一般需要選擇光圈F值盡量小的鏡頭。另外,如果鏡頭是電動的,我們可以省卻打開機箱,反復手工調整光圈和聚焦等的煩惱。

 

其他我們需要考慮的包括光源、濾光片和暗箱等部件。光源的種類和發光的均一度,濾光片的數量和暗箱的遮光效果等均在我們的考慮范圍之內。當然,一般如果成像儀的CCD和鏡頭配置不錯,一般這些部件也不會太差。

 

2、看自己的用途

市場上各品牌、各型號的成像儀林林種種,但是從成像原理上可以分成兩大類,分別是拍照成像和掃描成像。

 

拍照成像簡單說就是樣品和相機的相對位置不動,可以進行單次成像或多次成像;掃描成像則是相機對樣品進行局部成像,然后通過樣品或相機的移動對整個樣品進行成像。

 

拍照成像目前主要采用CCD相機成像,由于可以設置不同的曝光時間,常被用來進行微弱的化學發光及生物發光的成像。而掃描成像則由于精度高、重復性好被廣泛用于大型樣品以及多通道成像中?？梢哉f,對于大型樣品或多通道應用,能選擇掃描成像的,盡量不要選擇拍照成像。

 

原理搞清楚了,選擇起來就簡單了。不同的原理導致了不同應用的佳選擇,所以千萬不要相信什么“全能王”之類的鬼話,沒有任何一款機器可以通吃所有應用領域。下面就實驗室常見的一些應用簡單的說明選擇的依據:

 

(1)核酸電泳凝膠:一般此類凝膠都采用EB染色、紫外激發,而且凝膠較小。推薦采用一般的凝膠成像設備即可完成。

 

(2)蛋白電泳凝膠:一般此類凝膠采用考染或銀染,白光透射成像。對于小型凝膠您可以選擇一般的凝膠成像設備,但是對于大型凝膠,特別是雙向電泳凝膠,由于CCD拍照成像會有幾何扭曲,而且透鏡效應也會導致不同區域的信號強度差異,另外CCD拍照也無法保證不同凝膠的成像參數保持一致,因此掃描成像是好選擇。

 

(3)轉印膜:這個稍微有些復雜。一般轉印膜有比色法顯色、同位素、化學發光和熒光等不同檢測手段。

 

比色法顯色就是產生有顏色的條帶或斑點,一般采用普通的凝膠成像設備即可。

同位素可以采用壓膠片曝光的方法,但是費時、費力而且容易過飽和。

 

比較通用的方法是由FujiFilm在1981年發明的磷屏成像技術,獲得信號潛影的磷屏通過激光掃描就可以獲取同位素的信號。而化學發光是目前常用的蛋白印跡的檢測手段,無疑,冷CCD拍照成像對這種微弱的光信號是合適的。

 

熒光是所有這些檢測手段中令人贊嘆的和有前景的。這不僅僅是因為熒光染料具有寬的動態范圍,而且還在于它能夠為我們提供多通路的檢測途徑(同樣適用于凝膠)。當然,您可以使用單一熒光檢測,這時您對凝膠成像設備的要求就包括了新的激光光源和相應的濾光片。如果您是一個完美主義者,或者您需要對鄰近或重疊的目標分子進行成像,那么多通道熒光檢測是您的不二之選。這時掃描成像是佳選擇,這樣選擇不僅僅是因為掃描成像能夠帶來更高的靈敏度和分辨率,更重要的是,不同通道 之間沒有幾何扭曲,擬合性好。

 

微孔板及其他特殊需求:對于拍照成像而言,由于幾何扭曲的問題,對微孔板成像就變得比較復雜了,一般必須一個專用的校正裝置才可完成。當然,如果采用掃描成像一般不需要任何額外 附件。很多實驗室現在都對小動物成像非常感興趣,然而對小動物進行真的不是一件簡單的事,一方面小動物需要進行麻醉和固定;另一方面還需要對信號位置進行三維定位。因此,能同時提供功能、代謝和解剖圖像的PET/CT是進行這類成像的有力的工具。

 

3、看研究類似的同行

好用才是硬道理。任憑你說得天花亂墜,拿來我試試,不就什么都清楚了?，F在多數廠商都提供Demo機服務,還有技術人員現場答疑解惑,那就請各位上場,真刀真槍的拼一下,誰的性能好,價格優,那我就要誰的。

 

當然,我們的實際測試結果僅僅是針對我們自己的樣品和現場demo的機器而已。我們不能據此對相關品牌和相關型號做太多評判。由于具體應用的限制、操作技巧的差異以及可能的儀器狀態的區別,我們有可能沒有給出公允的評價。但無論如何,這些訊息對我們采購者和使用者來說都是非常重要的。

 

4、看售后

很多用戶認為,買來后擺在實驗室使用的只是一臺儀器而已。其實,事實遠不是這樣。買儀器來是為了使用,而能否用好,除了我們自己的聰明才智和勤學苦練之外,廠家的技術支持必不可少。因此,要買就買原廠貨已經成為很多用戶的共識,因為這樣就可以享受到廠家現場技術支持和指導。