《中國藥品標準》雜志  第22巻  第5期

劉江1，2，吳海軍1，陳興福1

(1. 四川農業大學農學院，成都 611130；

2. 成都大學藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室，成都 610106)

 

摘要：通過本草文獻綜述，梳理了黑豆作為藥材使用的歷史簡況；并結合藥化分析試驗比較了不同籽重黑豆的化學成分和生物活性，對其化學鑒別、質量評價方法提出了新的商榷建議。推薦臨床以百粒重小于18 g的小黑豆入藥，建議新版《中國藥典》明確以矢車菊素葡萄糖苷為對照品鑒別其真偽；采用高效液相色譜法檢測其含量，并以此作為黑豆質量評價標準。

 

關鍵詞：黑豆；中華人民共和國藥典；大豆花色苷；異黃酮；鑒別標準

 

Discussionon identification method and quality evaluation standard of Traditional

Chinese Medicine “Heidou” in the Chinese Pharmacopoeia

LIU Jiang，WU Haijun， CHEN Xingfu

(1. College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130， China；

2. Key Laboratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine， Chengdu University，Chengdu 610106，China)

 

Abstract： The brief history of black soybean (SOJAE SEMEN NIGRUM) as Traditional Chinese Medicine was reviewed based on literatures review. The chemical composition and biological activity were compared among black soybean seeds with different weight by chemical analysis methods.The new chemical identification and quality evaluation method for black soybean in the Chinese Pharmacopoeia were discussed. It is recommended that small black soybean (100-grain weight＜18 g) is appropriately admitted in the new edition of the Chinese Pharmacopoeia. Soybean anthocyanins can be used as a reference substance to identify the black soybean seed，and high performance liquid chromatography method is used for quality evaluation standard of black soybean.

 

Key words： black soybean; Chinese Pharmacopoeia;anthocyanin; isoflavone; identification method

 

黑豆為豆科Leguminosae大豆屬Glycine植物Glycine max (L.) merr的黑色種子，是著名的藥食同源植物[1，2]；黑豆與其他種皮顏色大豆(黃、棕、綠、雜色等)一樣，均同屬于Glycine max (L.) merr一種[1]，但其藥用功效差異較大。一方面，因其高蛋白、高不飽和油脂含量，黑豆是重要的糧經作物；另一方面，黑豆含有豐富的異黃酮、花色苷等功能性成分，亦作為保健食品或傳統藥物在中國及東南亞地區均有長期、廣泛的使用[3]。大豆及其制品的藥用歷史悠久，歷代本草及農書文獻中均有記載；其中，尤以黑豆藥用價值最高，其性甘、平，歸脾、腎經；具有益精明目，養血祛風，利水，解毒功能。用于陰虛煩渴，頭暈目昏，體虛多汗，腎虛腰痛，水腫尿少，痹痛拘攣，手足麻木，藥食中毒[2]。自《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2010年版始，大豆黃卷(藥材名：SojaeSemen Germinatum)與黑豆(藥材名：Sojae Semen Nigrum)正式作為單列藥材分別被《中國藥典》收錄[2，4]。但藥用黑豆的來源、鑒別與質量評價尚存爭議。本文梳理了黑豆在歷代本草中的施用情況并結合現代藥化分析試驗結果，提出了黑豆鑒別方法的商榷及質量評價標準建議，以求為黑豆藥材的藥典標準更新提供參考。

 

1 大豆及黑豆藥用的本草考證

 

大豆藥用記載始于《神農本草經》[5]：“生大豆：涂癰腫，煮汁飲，殺鬼毒，止痛……”；三國·曹魏吳普所著《吳普本草》[6]米食類記載：“生大豆，神龍、歧伯：生溫熟寒，九月采，殺烏頭毒……”；梁·陶弘景《名醫別錄》[7]：“生大豆：味甘，平，逐水脹，除胃中熱癢，傷中，淋露，下癖血，散五藏結積，內寒，殺烏頭毒。久服令人身重，熬屑，味甘，主治胃中熱，去腫，除癢，消谷，止腹脹……”；唐·蘇敬《新修本草》[8]米部卷第十九：“生大豆：味甘，平。涂癰腫，煮汁飲，煮飲汁，殺鬼毒，止痛……”。唐·孫思邈《千金翼方》[9]卷四米谷部：“生大豆，味甘，平。涂癰腫。煮汁飲，殺鬼毒，止痛，逐水脹，除胃中熱痹，傷中淋露，下瘀血，散五臟結積，內寒，殺烏頭毒……”。從秦漢三國到漢唐時期，歷代本草均有關于大豆藥用的記載，不難看出，其功能主要以大豆蛋白中和烏頭毒性為主，也兼有利水、消脹等功效。

 

在歷代藥用實踐中，黑豆因其獨特的藥效，逐漸從大豆中獨立出來，成為一味特殊的藥材，如：《本草綱目》[10]第二十四卷谷部三記載：“大豆有黑、青、黃、白、斑數色，惟黑者入藥，而黃、白豆炒食作腐，造醬榨油，盛為時用，不可不知別其性味也”；“時珍曰：按：《養老書》云：李守愚每晨水吞黑豆二七枚，謂之五臟谷，到老不衰。夫豆有五色，各治五臟。惟黑豆屬水性寒，為腎之谷，入腎功多，故能治水消脹下氣，制風熱而活血解毒，所謂同氣相求也”。中醫認為，黑豆性味甘、平，入脾腎經，有補腎益陰、健脾利濕、祛風除痹、解毒之功。清·張璐《本經逢原》[11]卷三谷部：“入腎經血分，同青鹽、旱蓮草、何首烏蒸熟，但食黑豆，則須發不白，其補腎之功可知。今人以制何首烏，取以引入腎經也”。

 

在本草施用過程中亦逐步衍生出對黑豆大小形態的描述性區別，并以此探討其藥效差異。北宋·蘇頌《本草圖經》[12]米部卷第十八：“生大豆有黑白二種，黑者入藥，白者不用。其緊小者為雄豆，入藥尤佳……”；明·倪朱謨《本草匯言》[13]卷之十四谷部菽豆類：“零烏豆又名馬料豆。味甘、苦、咸，氣寒，無毒。陳氏曰：零烏豆，即黑豆之形扁者，非黑大豆之黑而粗。又非穭豆之黑而細也”；明·陳嘉漠《本草蒙筌》[14]卷之五谷部：“生大豆：味甘，氣平。無毒。原產泰山平澤，今則處處有之。黑白種殊，性取黑者入藥；大小顆異，須求小粒煎湯。（自注：緊小者為雄豆，入藥方效）。”由此可以看出，大量的傳統醫藥實踐表明，小粒黑豆的藥效更強。

 

2 大豆來源藥材在藥典中的收錄情況

 

黑豆在歷代本草中均有收錄，2005年版《中藥大辭典》更是將“黑大豆”、“黑大豆葉”、“黑大豆皮”、“黑大豆花”分條單列[15]，并分別注釋其不同的功效。而自2010版《中國藥典》起才正式將“黑豆”列入一部“藥材和飲片”中，與其同時列入的大豆來源藥材還有“大豆黃卷”；后續各版藥典中關于大豆黃卷與黑豆藥材的描述均完全一致[2，4]。兩味藥材基原均為豆科植物Glycine max （L.）merr，其中，大豆黃卷為大豆經發芽干燥的炮制加工品，而黑豆為大豆的黑色干燥成熟種子。

 

詳細比較上述兩味藥材的鑒定方法可知，大豆黃卷的兩項鑒別方法均采用了薄層色譜法，包括對兩類目標成分的比對檢定：一是以氨基酸為檢定目標，采用稀乙醇超聲提取樣品，以亮氨酸為對照品，以茚三酮顯色對照標準藥材鑒別；二是以大豆異黃酮為檢定目標，采用80%乙醇超聲提取樣品，以染料木苷為對照品，以2%三氯化鋁顯色對照標準藥材鑒別。而黑豆藥材的鑒別方法則采用了粉末顯微鑒定與薄層色譜法兩種方式：一是以粉末顏色、種皮柵欄細胞、子葉糊粉粒和脂肪油滴及草酸鈣結晶為特征的物理鑒定；二是以大豆異黃酮為檢定目標，采用大豆苷和大豆苷元為對照品，以紫外燈254 nm檢視，與標準藥材對照鑒別[2]。由此可見，《中國藥典》對這兩味藥材的化學鑒別均采用了以大豆異黃酮為對照品，正相薄層色譜比對的方法。

 

此外，《中國藥典》中也注明了大豆黃卷的含量測定方法，主要是以70%甲醇回流提取樣品，以大豆苷和染料木苷為對照品，采用高效液相色譜法梯度洗脫定量分析，以大豆苷和染料木苷的總量不低于0.08%為正品。而黑豆藥材尚缺乏具體的化學質量評價標準[2]。

 

3 不同類型黑豆化學成分及生物活性比較

 

通過對歷代本草的梳理，可以看出，小粒黑豆具有更強的藥效，為此，我們搜集了40余個市售黑豆品種，對其百粒重進行了考察[16]。根據《中國農業百科全書》中有關中國大豆品種分類標準，按照籽粒重量將其分為大粒（百粒重18 g以上），中粒（百粒重12～17.9g）、小粒（百粒重11.9 g以下）三類[17]；本研究的供試黑豆材料中，共有16個大粒黑豆（最大百粒重為40.3g）、13個中等黑豆（平均百粒重15.6 g）、11個小粒黑豆（最小百粒重為5.5g），三者彼此間的百粒重均呈現極顯著差異（圖1）。

 

同時，我們采用液相色譜質譜聯用法，定量分析了上述黑豆材料的4類異黃酮（異黃酮苷元(E)、葡萄糖糖苷（G）、丙二酰基異黃酮苷(M)、乙酰異黃酮苷(A)[18]、8種花色苷[飛燕草素半乳糖苷(DEA)、飛燕草素葡萄糖苷(DEL)、矢車菊素半乳糖苷(CYA)、矢車菊素葡萄糖苷(CYL)、天竺葵素葡萄糖苷(PEL)、矮牽牛色素葡萄糖苷(PET)、芍藥色素葡萄糖苷(PEO)、矢車菊素(CYC)][19]含量；采用氣相色譜質譜聯用法定量分析了5種脂肪酸[棕櫚酸(PA)、硬脂酸(SA)、亞油酸(LA)、油酸(OA)、亞麻酸(ALA)]含量；此外，我們還分析了總蛋白質（T-Pro，凱氏定氮法）、可溶性蛋白（S-Pro，考馬斯亮藍法）、可溶性多糖（S-Pos，硫酸苯酚法）[20]等主要化學成分含量及四類抗氧化活性【亞鐵還原能力(FRAP)[21]、羥基自由基清除活力(·OH)[22，23]、二苯代苦味酰基自由基清除活力(DPPH)[19]、活性氧清除活力(ORAC)[21]】。

 

并基于上述多元化學及活性指標，對籽粒大小不同的三類黑豆進行了正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。結果發現，CYL、PEO、PEL等花色苷含量及其總量T-AC在小粒黑豆中的含量最高，其DPPH、FRAP抗氧化活性也最高；中等黑豆中G、M、A異黃酮及其總量T-IF，PET、CYA、DEL等花色苷含量較高，其ORAC、·OH自由基清除活力也較高（圖2）。總體上可以看出，小粒到中等大小黑豆的黃酮類成分含量及其抗氧化活性均較高，這與歷代本草中記載的藥用黑豆的描述一致，即：“緊小者為雄豆，入藥方效”。

注：不同大寫字母間表示不同籽粒大小樣本間差異極顯著，P＜0.01）（The different capital letters above bars indicate significant differences among soybean seeds with different weight，P＜0.01）

圖1  不同粒重黑豆百粒重比較[16]

Fig.1  100-grain weights of black soybean seeds

 

圖2  正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得分圖（A）與載荷圖（B）[16]

Fig.2  OPLS-DA score plot （A） and corresponding loadings scatter plot （B） ofblack soybean seeds with different weight

 

4 黑豆鑒別方法的商榷及含量測定建議

 

4.1 《中國藥典》黑豆鑒別方法的商榷依據

 

現行版《中國藥典》中關于黑豆的化學鑒別，主要以大豆異黃酮為檢定目標，采用大豆苷和大豆苷元為對照品，與標準藥材進行薄層色譜對照鑒別。該鑒定方法有如下幾點值得商榷：一是與《中國藥典》收錄的另一味藥材“大豆黃卷”的鑒別方法基本一致[2]，不同的兩味藥材采用幾近一致的鑒別方法，值得商榷；而大量文獻表明，大豆籽粒中異黃酮含量以葡萄糖糖苷（G）和丙二酰基異黃酮苷（M）為主，二者占到大豆異黃酮總量的80%以上，而異黃酮苷元（E）含量甚微[18]，以微量異黃酮苷元為對照品比對的做法，有失偏頗。

 

二是根據現代藥化分析結果（圖3），小粒黑豆與中粒黑豆的花色苷含量無顯著差異，但均達到3.0 mg·g-1以上，且極顯著高于大粒黑豆花色苷含量（1.8 mg·g-1）；結合傳統本草記載不難看出，傳統中醫所用黑豆應為花色苷含量極高的中小粒黑豆（百粒重＜18 g），并非大粒黑豆，其鑒別方法應以花色苷為檢定對象，而非異黃酮；栽培大豆種皮具有多種顏色，藥典僅收錄了黑色種皮之黑豆入藥，與其他顏色大豆相比，其植物基原均為Glycine max （L.）merr，均可檢出不同程度的異黃酮含量[24]，黑豆有別于其他顏色大豆的重要特征應是其黑色素類化合物--花色苷。

 

注：不同大、小寫字母間表示不同籽粒大小樣本間差異顯著（P＜0.01或0.05）。[Note：different upper case/lower case letters above bars indicate significant differences among soybean seeds with different grain sizes，P＜0.01 or0.05)]

圖3  不同籽粒大小黑豆花色苷含量比較[16]

Fig.3  The content comparison of anthocyanin in black soybean seeds

 

第三，黑豆花色苷與其中醫臨床功效密切相關[25]，現代藥理研究也表明，基于黑豆消除自由基活性，其具有抑制細胞損傷[26]、抗炎[27，28]、抗腫瘤[29]、預防糖尿病[30]等多方面的藥用功效；在黑豆種皮中大量積累的大豆花色苷作為強氧化抑制劑，其抗氧化活性顯著高于異黃酮[3]，是黑豆有別于普通黃豆特有的主要藥效成分，其含量約占黑豆干重的1%～2%。

 

第四，本文重點在于鑒別正品黑豆藥材；抗氧化活性固然無法完全涵蓋黑豆的功能主治，但從中醫基礎理論講“豆乃腎之谷，黑色屬水，水走腎…”，即黑色種皮是黑豆作為中藥使用的重要特征，而花色苷類成分是其黑色的唯一來源，因此，花色苷既可作為鑒別成分，也可用作質控標準，

 

另外，在現實生活中，黑豆因其具有較高的功能活性和保健價值，相較于黃豆而言，黑豆價格遠高于普通黃豆，因此，不乏有不法商販以黃豆染色冒充黑豆的現象出現。若采用現行鑒別方法，以大豆異黃酮為檢定指標，難以鑒別類似偽品，因而采用花色苷為檢定目標，也具有重要的現實意義。

 

4.2 黑豆鑒別方法及含量測定建議

 

正品黑豆藥材花色苷類化合物的含量極高，其主要以糖苷形式存在，主要包括飛燕草素半乳糖苷、飛燕草素葡萄糖苷、矢車菊素半乳糖苷、矢車菊素葡萄糖苷、天竺葵素葡萄糖苷、矮牽牛色素葡萄糖苷、芍藥色素葡萄糖苷等8種單體化合物；其中以矢車菊素葡萄糖苷的含量最高[19]，占到總花色苷含量的90%以上；而矢車菊素葡萄糖苷在其他植物體內廣泛分布，單體化合物純品容易獲得，商品化標準品價格較低，以其為對照品可實現正、偽品黑豆的有效鑒別。

 

大豆花色苷在自然狀態下主要以離子態形式存在，其水溶性極好、極性較大，受溫度、光和pH值等環境因素的影響而極易降解（酸性環境中相對穩定）[31]。結合相關文獻報道[19，32]，建議使用鹽酸-80%甲醇水溶液（1∶99）為提取溶劑，采用反相薄層色譜法，以“甲醇-水-甲酸”為展開劑，或采用正相薄層色譜法，以高極性“氯仿-甲醇-水”為展開劑，以矢車菊素葡萄糖苷為對照品鑒別[32]。

 

同時，黑豆藥材的含量測定方法可參考已有文獻[32]，建議采用高效液相色譜法，以矢車菊素葡萄糖苷為對照品，使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以10%甲酸水溶液-甲醇/乙腈/水/甲酸（22.5/22.5/40/10，V/V）混合系統為流動相梯度洗脫；以520 nm紫外檢測[33]或電噴霧離子源質譜檢測[34]。結合已有文獻報道及本文實踐，建議按干燥品計算，以花色苷總量不低于2.0 mg·g-1為黑豆藥材的質量評價標準。

 

5 小結

 

黑豆在歷代本草中均有大量藥用記載，其植物生源地域分布廣泛，與普通百姓的生活密切相關，是典型的藥食兩用植物。自《中國藥典》2010版收錄黑豆藥材至今的數年間，黑豆偽品時有出現，現行《中國藥典》鑒別方法的適用性值得商榷。本文結合歷代本草中關于黑豆形態、功效的描述，并結合現代藥理藥化分析，指出傳統藥用黑豆應為花色苷含量較高的小粒黑豆，建議新版《中國藥典》采用以矢車菊素葡萄糖苷為代表的大豆花色苷作為正品黑豆藥材的對照品，以實現黑豆藥材的正品鑒別與質量控制。

 

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