一. 菌落總數所使用標準

 

食品企業一般會用到的兩個做菌落總數的標準（當然還有其他標準）：

 

食品國家標準：

 

GB 4789.2-2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》

 

生產用水：

 

GB/T 5750.12-2006 《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》

 

以這兩個標準來說，它們的檢測方法是差不多，主要區別在于培養基的不同和樣品的狀態不同（食品中有固態和液態，生活飲用水只有液態）。食品的培養基是使用PCA，生產用水的使用NA。

 

二. 培養基成分

 

1. PCA（平板計數瓊脂培養基）

 

胰蛋白胨       5.0g

 

酵母浸膏       2.5g

 

葡萄糖          1.0g

 

瓊脂           15.0g

 

蒸餾水     1000mL

 

注：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母浸粉提供B族維生素；葡萄糖提供能源；瓊脂是培養基的凝固劑。

 

2. NA（營養瓊脂）

 

蛋白胨        10g

 

牛肉膏        3g

 

氯化鈉        5g

 

瓊脂          14g（標準10g-20g）

 

蒸餾水        1000mL

 

注：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源;氯化鈉能維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養基的凝固劑。

 

三. 檢測方法

 

 

四. 操作注意細節

 

1. 菌落總數是比較常規的微生物檢測項目，也是比較容易做的一個微生物檢測方法，主要注意無菌操作，與稀釋液均勻性。

 

2. 在空白出現菌落的時候需要去分析哪一步出現問題，人機料法環。當然空白出現菌落的時候，那么該批次的菌落總數數據都作廢處理。在制樣和做樣的時候需要在百級的環境（百級的潔凈工作臺）下進行。

 

3. 稀釋液的均勻性，這個會影響結果，剛開始的時候可能會造成同一梯度的兩個結果相差有點遠，這個是因為做的時候沒有把稀釋液均勻。如果前后兩個梯度沒有梯度性，那么就是在做稀釋做不好。這個都是靠多做，技術才會提高。（當然還有一種情況，樣品是中添加了抑菌物質，這樣沒有梯度性。）

 

五. 計數

 

1. 可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits , CFU )表示。

 

2. 選取菌落數在 30CFU~300CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于 30CFU的平板記錄具體菌落數，大于 300CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

 

3. 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。（這個是很多新手會問的一個問題）

 

4. 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。

 

6. 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每 g ( mL )樣品中菌落總數結果。

 

7. 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式( 1 )計算:

 

 

8. 若所有稀釋度的平板上菌落數均大于 300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。

 

9. 若所有稀釋度的平板菌落數均小于 30CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

 

10. 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數計算。

 

11. 若所有稀釋度的平板菌落數均不在 30CFU~300CFU 之間，其中一部分小于 30CFU 或大于300CFU 時，則以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

 

六. 菌落總數的問題

 

1. 有新人可能會拿著菌落總數的平板去問別人這是什么菌？

 

答：這是看不出來的，菌落總數只能檢測出樣品衛生情況，一個樣品的細菌數量，不能驗證出什么菌。這是一個不應該犯的誤區。

 

2. 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU之間,其中一部分小于30CFU或大于300CFU 時。就會有人不知道怎么去判定那個梯度更接近30-300。

 

舉例：一個梯度：28/28；另梯度：305/305，那么那個數據更接近呢？

 

兩個方法（網友提供）：

 

①按標準字面意思直接做差比較后再乘以稀釋倍數：28-30=-2，他們相差2；305-300=5，他們相差5。2比5要小，那么采取28相應的梯度再乘以稀釋倍數；

 

②恢復為同稀釋度做差比較：把兩個梯度換算成同一個梯度，一般把28換算成280。280-300=-20，相差20；305-300=5，相差5。20比5要大，那么采取305相應的梯度。

 

（個人意見：我是更偏向于第二種，因為要在同一個梯度上做比較才能體現出數據的可靠性，同時我偏向采用前一個梯度的數字，那么這個數值可以減少一步步驟帶來的誤差，數據可能更加接近樣品的情況）

 

3. 有時候會出現這么一個情況，最低稀釋梯度中一個平板出現1個菌落，另一個無菌落生長。那么結果怎么出呢？

 

答：（以固態為例子）在過去也有討論過，有人認為報告寫5，也有認為報告寫＜10（比較兩個平板均無菌落生長的時候報＜10）這個兩個報告方法其實也是可以采用。（我是采用第一種；個人理解不長報告＜10，那么長了也報＜10嗎？不太合理）

 

4. 在做菌落總數的時候，有時候會樣品和菌落分不清的（老前輩不會這樣），那么如何區分兩種物質呢？

 

答：在培養基中添加TTC（一般2%濃度1mL加到400mL的培養基中，TTC的濃度不要過高，會有抑制作用）。TTC的原理：TTC和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲月贊。那么生長的菌落會變成紅色，這樣就可以區分菌落與樣品。

 

還有一個方法：4℃冷藏保存一個樣品和培養基混勻的平板做對照，觀察菌落的形態特征，老前輩們基本靠這個去區分的。

 

5. 菌落總數計數包括霉菌嗎？

 

答：菌落總數的概念是這么規定的，食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度、培養時間等）培養后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數。所以也包括在PCA上生長的霉菌和酵母等微生物。

 

6. 培養基溫度不好控制？

 

答：前提是培養基滅菌好了放在水浴鍋內保溫46攝氏度。使用時一個同事在外面把培養基從水浴鍋拿到傳遞窗，培養基表面噴酒精殺菌，然后開啟傳遞窗的紫外燈5min（這一步是對培養基表面殺菌，減少對潔凈房的污染）。里面的同事5min之后拿起來放在手心人體不覺燙手，這樣的溫度最佳倒平板。（注意：倒平板的速度要快，一次最好只拿一瓶，避免培養基凝固）

 

7. 有些朋友不理解菌落總數的單位CFU的意思。

 

答：CFU為Colony-Forming Units英文縮寫，其含義是形成菌落的菌落個數，不等于細菌個數。（比如兩個相同的細菌靠得很近或貼在一起，那么經過培養這兩個細菌將會形成一個菌落，此時就是2個細菌，1CFU）。菌落總數往往采用的是平板計數法，經過培養后我們數出平板上所生長出的菌落個數，從而計算出每毫升或每克待檢樣品中可以培養出多少個菌落，于是以CFU/mL或CFU/g報告之。

 

8. 菌落超標的危害。

 

答：食品的菌落總數嚴重超標，說明其產品的衛生狀況達不到基本的衛生要求，將會破壞食品的營養成分，加速食品的腐敗變質，使食品失去食用價值。消費者食用微生物超標嚴重的食品，很容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀，危害人體健康安全。

 

但需要強調的是，菌落總數和致病菌有本質區別，菌落總數包括致病菌和有益菌，對人體有損害的主要是其中的致病菌，這些病菌會破壞腸道里正常的菌落環境，一部分可能在腸道被殺滅，一部分會留在身體里引起腹瀉、損傷肝臟等身體器官，而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落總數超標也意味著致病菌超標的機會增大，增加危害人體健康的幾率。

 

9. 培養后的培養基出現干裂情況。

 

答：干裂是由于培養基里面的水份缺失導致，所以當出現干裂情況，先要觀察干裂平板的數量和位置?？词欠袷桥囵B箱內部溫度不穩定導致（一般平皿一疊可以放置六個，同時要注意每疊之間需要保留一點間隙讓其通風）；排除儀器的原因之后，看是培養基否倒得太薄（初學者可以拿三角瓶裝水進行練習）；還有其他原因，其實在出現干裂的情況下，結果是無效的（除非干裂情況不嚴重）。排查出問題所在，可以避免我們下次再犯錯。

 

10. 培養基的配置。

 

答：培養基的包裝上（標準上）都會寫著先煮熱溶解再分裝，那么是不是一定要煮熱溶解呢？首先瓶子上的配置方法是直接配置一升的PCA，這里是必須要煮熱溶解（防止不均勻，使得部分培養基不凝固）。

 

其實配置培養基有兩個方法：第一個：用一個大容器配置培養基，然后加水煮熱溶解（注意攪拌，防止燒焦），待溶解完成之后進行分裝（這里需要注意安全），再去滅菌。第二個方法就是使用500mL三角瓶（其他容器也可以）配置300mL的培養基，加水稍微溶解（此步不需要加熱），再拿去滅菌。