為確保對色譜峰進行正確的測量（或積分），需要分析人員對積分結(jié)果進行準確性和一致性判斷。在大多數(shù)情況下，人為參與的過程往往會導(dǎo)致判斷結(jié)果受到非客觀標準的影響。所以色譜積分的合理合規(guī)性尤為重要，這也是監(jiān)管機構(gòu)的審查重點，這篇文章我們將簡要討論如何對色譜積分進行合理合規(guī)性控制。

1       簡介

高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）是現(xiàn)代分析實驗室中最常用的技術(shù)。這兩種技術(shù)的專屬性、靈敏度和靈活性使其適用于廣泛的樣品基質(zhì)中絕大多數(shù)被分析物的測定。這兩種技術(shù)的原始輸出都是信號強度對比時間的曲線圖，通常稱為色譜圖。色譜圖中的各個峰分別對應(yīng)于樣品中的各個成分，而峰面積通常正比于樣品中相應(yīng)成分的濃度。

要定量樣品中的被分析物濃度，就需要對色譜圖進行積分以測量峰的面積。現(xiàn)代高效液相色譜法和氣相色譜儀配備的電腦色譜數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)，都具備自動化積分的功能，分析人員需要做的主要是設(shè)定適當?shù)姆e分參數(shù)（例如：斜率靈敏度，噪聲閾值，峰寬閾值，峰面積的閾值，峰高閾值，撇去率等），軟件將依據(jù)這些參數(shù)來對各個色譜峰進行確認和積分。

2       監(jiān)管要求

由于分析人員可以根據(jù)自己的主觀判斷人為地設(shè)定積分參數(shù)，無論在常規(guī)審查或藥品生產(chǎn)上市授權(quán)評估過程中，對色譜峰正確和精確的積分及其過程都是重點審核內(nèi)容。

從美國FDA對藥企發(fā)布的警告信中，可以看到關(guān)于色譜積分的一些更加具體化的要求：不允許采用手動積分。

需要開啟色譜軟件的審計跟蹤功能，并將包含積分參數(shù)的分析方法和原始數(shù)據(jù)一同保存，以確保方法的積分參數(shù)修改歷史可追溯。

“更改積分參數(shù)，以得到好的積分結(jié)果”是不可接受的。在審查過程中，沒有合理解釋的多次重新積分被認為是企圖人為操縱峰面積以獲得合格的結(jié)果。

方法一旦經(jīng)過驗證且被用于藥品的常規(guī)QC放行，對后續(xù)每個色譜數(shù)據(jù)的積分都需要使用該方法以確保一致性。FDA當前的期望實際上是傾向于將色譜方法“鎖定”以保證始終使用同樣的積分參數(shù)。

綜合來講，色譜峰的積分、積分參數(shù)的設(shè)定和驗證、積分參數(shù)的修改和再驗證等都要遵循科學(xué)合理的過程，并通過標準操作規(guī)程（SOP）或類似的文件進行控制。

3       控制色譜積分的合理合規(guī)性

那么，要怎樣控制色譜積分的合理合規(guī)性呢？我們分以下幾個小節(jié)來探討。

3.1       通用積分過程及參數(shù)

為了對積分參數(shù)進行設(shè)定，有必要了解色譜數(shù)據(jù)處理程序是如何進行積分的。這里將嘗試討論一個通用的過程，不同的色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可能在細節(jié)上有所不同。

色譜積分過程包括下列事件：

a. 確定初始基線

首先取第一數(shù)據(jù)點作為一個暫定基線點。然后積分器取一定數(shù)據(jù)點的平均值重新定義初始基線點。用作取平均值的數(shù)據(jù)點數(shù)是由峰寬函數(shù)決定的。在確立了的新的基線點前，第一數(shù)據(jù)點被取作初始基線點。

b. 連續(xù)追蹤和更新基線

隨著積分器不斷錄入新的數(shù)據(jù)點，基線點需要向后推移并更新。被接納為基準點，一個數(shù)據(jù)點必須符合以下條件：

它必須在所指定的由斜率閾值決定的基線閾值內(nèi)；

基線的曲率必須低于由斜率閾值確定的閾值；

累積總和不能超過指定的面積閾值；

基線以由峰寬值決定的速率不斷重置，直到檢測出色譜峰；

c. 色譜峰開始時間的識別和確認

當新錄入的數(shù)據(jù)點超出基線閾值，并且基線曲率超過由斜率靈敏度函數(shù)確定的設(shè)定值，即辨別出一個潛在的色譜峰。如果接下來的數(shù)據(jù)點保持上升，并滿足下列條件，積分器即識別出一個潛在的色譜峰開始時間。

斜率和曲率超過由基線閾值確定的限值；

連續(xù)的數(shù)據(jù)點之間的差值超過噪聲閾值；

潛在的色譜峰開始時間被確認的條件需要符合下列標準：

斜率繼續(xù)超過由基線閾值確定的限制；

累計面積超出峰面積閾值；

曲率變?yōu)樨撝敌纬汕肮拯c；

d. 色譜峰頂點的確認

峰頂點的確認需要滿足下列條件：

斜率通過零點并變?yōu)樨撝担?/span>

曲率變?yōu)檎担?/span>

后續(xù)數(shù)據(jù)點的值降低，且該數(shù)據(jù)點與后續(xù)3個數(shù)據(jù)點的峰面積差累計超過2/3的峰面積閾值；

e. 色譜峰終點的識別和確認

色譜峰潛在終點的識別條件：

斜率和曲率回落到由基線閾值確定的限值內(nèi)；

兩個連續(xù)的數(shù)據(jù)點之間的差值小于0.5倍噪聲閾值；

色譜峰終點的確認條件：

斜率和曲率保持在基線閾值確定的限值內(nèi)；

在方法建立過程中，依據(jù)不同參數(shù)對色譜積分事件的作用進行各參數(shù)（斜率靈敏度，噪聲閾值，峰寬閾值，峰面積的閾值，峰高閾值等）的設(shè)定。

3.2       未完全分離色譜峰

對于色譜峰的最準確的積分要求所有的峰完全分離。如有某些需要精確定量測定的峰沒有完全分離，首先需要優(yōu)化色譜分離條件。在經(jīng)過大量努力后還是不能獲得充分分離的情況下，可以考慮通過合理的積分獲取未分離組分相對的準確峰面積。

如果定量數(shù)據(jù)必須從未分離峰獲得，需要制定明確的規(guī)定，以便確定未分離峰應(yīng)該如何積分。這樣的規(guī)定應(yīng)該包含在什么情況下可以使用什么功能對未分離色譜峰進行積分，這些功能包括：

切線撇去；

指數(shù)撇去；

指數(shù)曲線擬合；

直線撇去；

前伸峰撇去；

拖尾峰撇去；

峰谷比；

谷高比；

谷垂直切分；

3.3       積分效果的基本要求

進行合理合規(guī)的積分需要明確怎樣才算是適當和準確的積分。筆者認為原則性的標準應(yīng)該是“不多不少”地積分。

為使同一實驗室內(nèi)不同分析人員有一個統(tǒng)一的標準，建議在書面文檔中用圖表來說明什么是可接受的色譜峰，什么是不可接受的色譜峰。如圖2，其中峰A表示可接受的積分峰；而峰B是不可接受的峰積分，因為峰的拖尾部分未被完全積入； 峰C也是不可接受的，因為將可能是基線漂移的區(qū)域積進去了。

3.4       積分參數(shù)的設(shè)定和驗證

在做主成分測定時，數(shù)據(jù)處理方法的控制相對容易。但是當涉及到有關(guān)物質(zhì)測定時，數(shù)據(jù)處理方法的開發(fā)和控制有時候是非常具有挑戰(zhàn)性的。建議在方法學(xué)的準確度和精密度驗證部分，專門考察改變積分參數(shù)對最終結(jié)果的影響。可以使用在回收率實驗中獲得的原始數(shù)據(jù)，對下面的主要積分參數(shù)進行系統(tǒng)化地測試（不同的數(shù)據(jù)處理軟件可能有不同的參數(shù)）：

斜率靈敏度；

峰寬閾值；

峰高閾值；

面積閾值；

噪聲閾值；

記錄并評估這些參數(shù)的改變對回收率計算結(jié)果的影響，并在滿足回收率標準（通用標準為98.0~102.0%）的參數(shù)組合中選擇居中的參數(shù)組合，以便獲得更好的方法耐用性。后續(xù)出現(xiàn)分析結(jié)果異常（如出現(xiàn)新的未知雜質(zhì)）需要重新設(shè)定積分參數(shù)時，這些對參數(shù)改變的研究數(shù)據(jù)，也可以為參數(shù)的可修改范圍提供依據(jù)。

3.5       特殊情況下積分參數(shù)的重新設(shè)定和驗證

分析人員有時候會遇到一些特殊情況。比如，一個通過驗證的方法，在常規(guī)分析時完全沒有問題，但在穩(wěn)定性測試期間，有時候后會有新的色譜峰、峰型改變、共洗脫峰等異常情況，這種情況下往往原來的分析方法不再適用。

如果是已上市藥品出現(xiàn)了上述異常情況，表示這些產(chǎn)品可能不符合規(guī)范，并應(yīng)啟動實驗室和生產(chǎn)調(diào)查，以表征雜質(zhì)，并確定其來源。這種情況一旦經(jīng)過確認，企業(yè)需要從市場上召回產(chǎn)品，因為一個產(chǎn)品降解特性的鑒定是銷售許可的先決條件。

在另一方面，如果異常情況出現(xiàn)在產(chǎn)品開發(fā)的早期階段，同樣需要表征雜質(zhì)和確定其來源。這時候分析人員可能需要修改數(shù)據(jù)處理方法或者整個分析方法并重新驗證。這種情況在藥物研發(fā)的早期階段經(jīng)常發(fā)生，可以說分析方法驗證應(yīng)被視為一個過程，而非一次性的工作。

4       結(jié)論意見

色譜峰的積分是在現(xiàn)代分析實驗室中最經(jīng)常執(zhí)行的活動之一。為了獲得一致的結(jié)果，每次分析數(shù)據(jù)的積分都需要使用相同的方式。正是出于這個原因，我們建議實驗室建立適當?shù)囊?guī)范和標準操作程序，為準確和科學(xué)的積分提供明確的依據(jù)。

此外，應(yīng)該建立明確的程序，規(guī)范方法開發(fā)和驗證階段的積分參數(shù)選擇和驗證。而經(jīng)核準的書面方法應(yīng)該包括合適的色譜積分參數(shù)，并指定允許分析人員在必要的異常情況下作出適當調(diào)整的范圍。一個方法一旦經(jīng)過驗證且被使用，之后對每個色譜數(shù)據(jù)的積分都需要用這個方法以確保使用相同的參數(shù)。而出現(xiàn)異常情況對方法做出調(diào)整后，需要重新驗證并對異常事件根源進行調(diào)查和合理的解釋。