概述

     2021年4 月 29 日，EDQM 宣布疊氮雜質是一種新的致突變物質。2021年6月，加拿大衛生當局，發布消息，賽諾菲-安萬特加拿大公司因疊氮雜質而召回 12 批厄貝沙坦藥物（商品名 Avalide 和 Avapro，涉及不同劑量），因為測試發現疊氮基雜質超過了可接受的限度。

      疊氮類化合物（結構見圖1）是醫藥行業中常用的化工原料，例如在抗高血壓藥物厄貝沙坦的合成中，通常需要使用三丁基疊氮化錫或疊氮化鈉以形成藥物結構中的四唑環；抗癌藥卡莫氟的制備中需要以疊氮化鈉和庚酰氯合成中間體異氰酸乙酯。由于該類化合物能夠抑制細胞色素氧化酶以及多種酶的活性，并導致磷酸化及細胞呼吸的異常，引起血管張力極度降低；損害生物細胞，阻礙生物的新陳代謝；在較低濃度水平時也可能會直接引起DNA損傷，導致DNA的誘變，從而引發癌癥，疊氮化物應根據人用藥物注冊技術要求國際協調會 (ICH)-M7指導原則作為致遺傳突變雜質進行控制，因此在藥物生產過程中，必須嚴格控制藥物和醫藥中間體中疊氮化物的含量.

      對藥物中疊氮化物的分析檢測已成為目前基因毒性雜質研究的重要話題之一，因此建立快速、靈敏、準確、可靠的疊氮離子分析方法十分必要。

      根據參考各國藥典及文獻，總結了部分含有疊氮類化合物類基因毒雜質藥物的種類，詳見表1。

常用的檢測方法

直接檢測法：

      目前疊氮類化合物的檢測方法較多，文獻報道的疊氮化物分析方法有容量分析法、紫外分光光譜分析法、GC法、GC-MS法、HPLC法、LC-MS法和離子色譜法（IC）等。其中容量分析法和分光光譜分析法在測定低濃度疊氮化物時不夠準確，很少用到。GC法和HPLC法要求對樣品進行特定的預處理，但也有文獻報道，使用HPLC-UV可直接測定沙坦類藥物中疊氮化物的殘留。目前USP規定的用于測定疊氮化物的最廣泛使用的方法是離子色譜法（IC），該法因其靈敏度高、選擇性好，快速方便的特點，成為近年檢測疊氮根的主要手段。根據文獻報道，離子色譜法應用于疊氮化物的檢測分為采用碳酸鈉洗脫系統的IC法和免化學試劑離子色譜分析法（RFIC），后者靈敏度高，選擇性好，已被廣泛應用于原料藥中疊氮化物的檢測。

衍生化法：

      當樣品不能直接進樣分析時，為了滿足分析方法的要求，同時也能夠提高疊氮化物的檢測靈敏度，通常會選擇柱前或柱后衍生的方法進行檢測。據文獻報道，可使用五氟芐基溴（PFBB）作為衍生化試劑，生成五氟芐基疊氮化物（PFB-Az）衍生物，然后采用反相HPLC-UV法檢測該衍生化產物即可測定原料藥中疊氮化物。除此之外，也有文獻報道采用丙酸酐或苯甲酰氯作為衍生化試劑生成酰基疊氮化物，使用配備有氮磷檢測器的HS-GC，在GC的加熱進樣器中，衍生物丙酰疊氮化物進行熱重排形成異氰酸乙酯，隨后對其進行色譜分離和檢測，從而測定樣品中的疊氮化物，該方法靈敏度極高，對疊氮化鈉的定量限為0.04 µg / mL目前已被廣泛應用。

案例

厄貝沙坦：

      厄貝沙坦（Irbesartan，化合物1，圖2）是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，主要用于高血壓的治療，減緩糖尿病腎病的發展等。在厄貝沙坦的合成工藝（圖2）中，中間體5與疊氮化鈉反應制得厄貝沙坦，而疊氮化鈉可能殘留于厄貝沙坦成品中，因此必須進行嚴格控制。根據ICH發布基因毒性雜質的最大攝取量為1.5 μg/d計算，厄貝沙坦的最大日劑用量為300 mg，則對應的基因毒性雜質疊氮化鈉的TTC水平為5 ppm。

      因此，采用免化學試劑離子色譜分析法（RFIC）測定疊氮化鈉。根據ICH指南要求，對該方法進行了檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準確性等相關驗證，疊氮化鈉在0.003~0.240 μg/mL的范圍內成良好的線性關系，相關系數R2=0.9995，疊氮化鈉的LOD和LOQ分別能夠達到0.0008 μg/mL及0.0029 μg/mL，平均回收率為100.26 %，本法靈敏、可靠、簡便、操作簡單且無機制干擾，適合在痕量水平下對厄貝沙坦中基因毒雜質進行控制，為厄貝沙坦工藝過程控制和質量保障提供參考依據。

頭孢孟多酯鈉:

      頭孢孟多酯鈉（Cemandil sodium salt，化合物6，圖3）是一種殺菌作用強的第2代半合成頭孢菌素。頭孢孟多酯鈉的合成工藝中以7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）和1-甲基-5-巰基-1,2,3,4-四氮唑為起始原料生成中間體7，經過硅化反應和酰化反應生成頭孢孟多酸（中間體9），再與異辛酸鈉成鹽得到頭孢孟多酯鈉。其中起始原料1-甲基-5-巰基-1,2,3,4-四氮唑的合成需要異硫氰酸甲酯和疊氮化鈉，依據EMA和FDA相應的指導原則，有必要對頭孢孟多酯鈉中的疊氮化鈉的殘留進行定量分析。根據ICH發布基因毒性雜質的最大攝取量為1.5 μg/d計算，頭孢孟多酯鈉最大日劑用量4 g，則對應的基因毒性雜質疊氮化鈉的TTC水平為0.375 ppm。

      因此，采用HPLC直接檢測的方法對疊氮化鈉進行定量，在該方法下LOQ為0.4 ppm，LOD 為0.2 ppm，在0.4~3.0 ppm的濃度范圍內均成良好的線性關系，相關系數R2=0.9997，回收率為92.7-102.3%。該方法快速、簡單、準確且經全面驗證后符合檢測的需求。

總結

      疊氮類化合物作為基因毒性雜質，通常作為起始物料、反應試劑或中間體存在于藥物合成過程中，這些物料可能會殘留于終產品中成為雜質，疊氮化物屬于劇毒物質，可引起中毒死亡。因此，藥品中如果含有疊氮化物殘留，藥品就會存在質量缺陷并對人類健康造成威脅，建立快速、靈敏、準確、可靠的分析方法以控制藥物中疊氮化物含量就顯得尤為重要。

      隨著基因毒性雜質法規逐步健全，藥政官方對基因毒性雜質的監管要求日益增高。近些年，在產品的上市申請中，由基因毒性雜質控制不合規導致的藥品質量缺陷越來越多，對消費者身體健康造成不可忽視的威脅，充分的基因毒性雜質研究已經成為產品能否上市的關鍵。因此，如何選擇最優的基毒雜質控制策略，以維持基毒雜質的危害最小化和企業開發藥品成本之間的平衡，已成為當下藥品生產企業必須面對的命題

本文根據以下文章進行編輯整理，僅用于學習、交流：.

1. Maja Griˇcar，Samo Andrenˇsek．Determination of azide impurity in sartans usingreversed-phase HPLC with UV detection．Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis  (2016) , 125, 27–32.

2. 李美君，姚先珍，汪秀林，王善斌，離子色譜法測定厄貝沙坦中疊氮化物，(2012), 9(32) , 239-240 , 118-124

3. 岑均達，馬霞，厄貝沙坦的合成，Chinese Journal of Pharmaceuticals  (2007), 38(3) , 239-240.

4. 張文生，胡文濱，夏建超，頭孢孟多酯鈉的合成，(2012), 35(10) , 27–30.