如果說氣血是我們身體里運行不息的精微物質(zhì)，那么如同動脈一樣流淌在液相色譜周身的流動相，決定著儀器各硬件的壽命。同時，它也是造成液相色譜各種問題的主要源頭。今天，小析姐和大家聊一聊如何選擇合適的流動相開始，為大家系統(tǒng)地分享流動相的相關(guān)內(nèi)容。

 

流動相的選擇

 

用水當選超純水，溶劑當用色譜純，大家都知道，在使用液相色譜儀的過程中，選擇純度高的溶劑/水，有利于實驗結(jié)果和儀器保養(yǎng)。

 

1、溶劑/水純度對HPLC分析的影響

 

（1）從實驗方法來說，如果有機溶劑或者水的純度差，比如含有一些有機物雜質(zhì)，就會影響基線，導致基線噪音變大或者基線漂移，有一些雜質(zhì)有額外的紫外吸收，會產(chǎn)生一些鬼峰，甚至會影響到方法的分離度。

 

尤其是水的使用，如果水中除了氫離子和氧離子之外，還有其它的電解質(zhì)的存在，有可能會因為重金屬的反應(yīng)，而對色譜峰的峰形造成影響。

 

（2）就儀器本身而言，質(zhì)量差的水或有機溶劑，還會引入一些顆粒物，堵塞色譜柱或者液相色譜儀的過濾芯，從而影響儀器性能增加維護成本。

 

2、有機溶劑純度的要求

 

不同的有機溶劑適用不同，比如化學純、分析純、優(yōu)級純，這種屬于通用化學試劑的純度分類，通常用于合成制備、工業(yè)生產(chǎn)或者化學實驗室研究類的工作；農(nóng)殘級、光譜純、色譜純，此種溶劑是根據(jù)所適用的儀器分析技術(shù)或者特殊分析領(lǐng)域來進行分類的。

 

所以我們在購買溶劑的時候一定要選擇更合適液相色譜的色譜純?nèi)軇?/span>

 

3、水的純度的要求

 

這里其實比較推薦大家使用純水儀制出來的水，因為一般實驗室還是用純水儀比較方便。在使用水的時候，我們都會用電阻率來衡量水的純度是不是符合液相色譜的要求，比如當純水儀制的水電阻率達到18.2MΩ才可以使用。

 

流動相的配制

 

顆粒雖微莫小覷，三個衛(wèi)士需上崗

 

流動相的配制是我們?nèi)粘嶒炞钇胀ǖ囊画h(huán)，也是做實驗的第一步，所以流動相配制的質(zhì)量直接影響到實驗的結(jié)果成功與否。

 

這里著重說一下影響流動相質(zhì)量的過濾和脫氣。

 

過濾，顆粒物堵塞系統(tǒng)對色譜分析的影響，無論是流動相還是樣品，都可能會有一些顆粒物的存在，如果顆粒物被引入了液相系統(tǒng)，不僅損害儀器，還會影響流速的準確性、流動相的混合比例以及方法的重現(xiàn)性。

 

此時就需要啟動保護流動相的三個衛(wèi)士，來去除這些顆粒物和雜質(zhì)。

 

第一個衛(wèi)士：流動相過濾

 

濾膜的材質(zhì)有多種，有些是適合過濾水相的，有些是適合過濾有機相的，也有一些可過濾有機相也可過濾水相的兼容濾膜。但大部分兼容的濾膜很容易被有機相溶解，在這里有兩點需要注意：

 

（1）不要用過濾水的濾膜來過濾有機相，也不要過濾水相和有機相的混合流動相，如果有機相把濾膜溶解了，不但起不到過濾作用，反而會引入新的雜質(zhì)，同樣會堵塞系統(tǒng)；

 

（2）另外需要注意的是，若使用常規(guī)顆粒的色譜柱，使用0.45μm的濾膜即可。若使用的是UHPLC，由于色譜柱填料比常規(guī)色譜柱小很多，所以建議使用0.2μm的濾膜對流動相進行過濾。

 

第二個衛(wèi)士：樣品過濾

 

雖然液相色譜的進樣量很少，是微升級的，但如果樣品中含有顆粒物，同樣會堵塞系統(tǒng)和色譜柱，所以樣品過濾很有必要。樣品過濾膜同樣有專門過濾水的和過濾有機相的，也有水相、有機相兼容的濾膜。

 

樣品過濾的建議步驟：

（1）建議注射器先吸入一點空氣，這樣能起到節(jié)省樣品溶液的作用；

（2）將樣品吸入注射器；

（3）將注射器翻轉(zhuǎn)導致，擦凈頂端的殘留物并將樣品過濾膜固定在注射器上；

（4）將溶液過濾后注入樣品瓶。

 

 

第三個衛(wèi)士：在線過濾器

 

目前有很多液相系統(tǒng)可以選擇安裝在線過濾器。在線過濾器里有一個篩板，我們將在線過濾器安裝在自動進樣器和色譜柱之間的流路里，增加一道防線來保護色譜柱。

 

 

脫氣，流動相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體。否則這些氣體會使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測器的信號產(chǎn)生很大的干擾。

 

（1）超聲波脫氣

將配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，也不影響溶劑組成。

 

注意：超聲時應(yīng)避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

 

（2）氦氣脫氣

氦氣緩緩的通過流動相趕去溶入的空氣，如果使用得當，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶入氣體。一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學檢測時經(jīng)常使用。

 

（3）真空脫氣

貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣，現(xiàn)在絕大部分高效液相色譜儀都配置有在線脫氣機模塊。

 

在線脫氣只適合脫完氣之后的流動相，在使用過程中的微量脫氣。

 

流動相的貯存

 

1、定期更換流動相，避光首選棕色瓶

 

流動相與儀器的管線和色譜柱直接接觸，保持流動相處于良好的狀態(tài)，有利于保持儀器和色譜柱的良好性能。

 

2、流動相變質(zhì)對液相色譜分析的影響

 

影響流動相變質(zhì)的因素主要來自光照、溫度和氧化，水、緩沖鹽和大部分有機相隨著時間的推移都會變質(zhì)，只要組成流動相的成分發(fā)生了變化，流動相的極性就發(fā)生了變化，從而導致保留時間漂移、重現(xiàn)性差。

 

3、緩沖鹽的存放與更換

 

不少用戶都很關(guān)心如何保存緩沖鹽，如何延緩緩沖鹽變質(zhì)的過程，延長使用時間？這就需要盡量來選擇棕色瓶來減少光照的影響，比如緩沖鹽配多了，多配的緩沖鹽要密封保存并放入冰箱冷藏，減少溫度帶來的影響。

 

如果保存得好，處于冷藏的環(huán)境下緩沖鹽能保存大約一周的時間，如果保存的不好，帶來的影響甚至是不可逆的，尤其是對色譜柱的影響。所以如果配緩沖鹽不是很復(fù)雜，最穩(wěn)妥的方法是現(xiàn)用現(xiàn)配。

 

4、水應(yīng)何時更換

 

如果同一個方法中的有機相受光照的影響比較小，可用棕色瓶放水，以此減少光照的影響，建議每天都換水，至少兩天換一次，比起水變質(zhì)對系統(tǒng)和色譜柱的影響來看，還是經(jīng)常換水來得更方便。

 

注意：若儀器長時間不開機，放水的瓶子或者管線里同樣會滋生微生物，所以一定要記得要把溶劑瓶里的水換成有機相，然后開機把管線里的水置換掉。

 

 5、有機溶劑的穩(wěn)定性

 

一部分常用的有機溶劑的穩(wěn)定性很差，比如像四氫呋喃、氯仿和二氯甲烷等氯代溶劑，對于這種穩(wěn)定性差的溶劑建議大家購買小體積包裝的有機溶劑。

 

注意：

（1）每次取完溶劑之后，要小心把瓶蓋擰緊來減少氧氣的影響；

（2）對于乙腈這樣比較穩(wěn)定的有機溶劑，若長時間不使用儀器，要避免純的乙腈充滿整個液相系統(tǒng)，防止乙腈產(chǎn)生的聚合物對儀器有所影響。

 

流動相的沖洗

 

1、沖洗系統(tǒng)細節(jié)多，尤其注意緩沖鹽

 

在開始實驗之前，我們需要沖洗并穩(wěn)定系統(tǒng)，在實驗結(jié)束之后，我們也需要使用適當?shù)娜軇_洗并保護系統(tǒng)。

 

2、置換系統(tǒng)流動相需要沖洗多長時間

 

其實我們很難用時間準確的說明這個問題，因為沖洗時間會受流速和柱體積的影響。

 

所以這里建議大家用沖洗體積來計算，由于液相系統(tǒng)中的管線和色譜柱都比較細，流速相對比較慢，所以流動相置換的過程是比較慢的，需要5~10倍以上的系統(tǒng)體積才能完全置換原有的流動相（并非專業(yè)術(shù)語，僅做問題舉例），所以只用知道系統(tǒng)體積即可。

 

系統(tǒng)體積包含儀器管線體積和色譜柱體積，比如管線體積是1ml，色譜柱的空余體積是3ml，系統(tǒng)體積就是4ml，用至少5倍的流動相沖洗，也就是需要20ml，10倍體積相當于40ml。有了沖洗體積，結(jié)合流速，自然就能計算出到底需要多長時間才能把體系置換好，沖洗干凈，比如，流速1ml/min時，大概需要20~40分鐘才能完全置換系統(tǒng)中原有的流動相。

 

 

以上溶劑比例，僅為舉例

 

3、實驗結(jié)束之后用什么溶劑保護體系

 

溶劑的選擇取決于色譜柱的類型，比如反相體系，色譜柱的體系基本為C8、C18類的，甲醇和乙腈是比較合適的溶劑，只是注意乙腈不能長期保存在液相系統(tǒng)中，因為乙腈有聚合的問題；

 

若是正相體系，比如氨基柱、氰基柱等正相色譜柱，正己烷是比較合適的溶劑，如果是離子交換柱，用水沖洗體系即可。

 

4、如何沖洗緩沖鹽

 

需要格外注意的是，緩沖鹽在有機相中是不溶解的，所以千萬不能用有機相直接沖洗緩沖鹽體系，否則鹽顆粒析出會堵塞管線和色譜柱，一定要有過渡。

 

這里建議分三個階段沖洗緩沖鹽體系：

（1）用大比例水，小比例有機相沖洗一段時間，這樣可以保證順利的沖走大部分鹽；

（2）加大有機相的比例再沖洗一段時間；

（3）根據(jù)沖洗體積的計算，確保緩沖鹽已經(jīng)完全被置換了之后再改為100%的有機相沖洗一段時間。