前言  作為一名質量分析人員，在分析方法開發、轉移或確認中，難免會遇到一些問題如色譜峰分叉、分析方法不能重現等，而導致這些問題的原因如溶劑效應、緩沖鹽選擇不恰當、色譜柱不合適等。筆者分享一個具體的案例。

最近，筆者在檢測某藥物（復合物堿（M）+酸（N））中的殘留溶劑（三氟乙酸）時發現，單獨進三氟乙酸對照品是一個峰，進系統適用性溶液（三氟乙酸+樣品）時發現三氟乙酸的色譜峰分叉，考慮是樣品原因引起的（主成分的色譜峰已經是平頂峰）。

其實驗條件如下：流動相（A）0.07%磷酸（PH3.0），流動相（B）甲醇；洗脫梯度：0-6min，100%A；6.01-20min，90%-50%A；20.01-30min，100%A；色譜柱：Ultimate AQ-C18；檢測波長：210nm；柱溫30℃；進樣量20µl；三氟乙酸儲備液為1.5mg/ml，三氟乙酸對照溶液0.15mg/ml；系統適用性溶液：供試品0.2g，先用純化水溶解，再加三氟乙酸儲備液，然后定容至20ml。

1、調查不同樣品量對三氟乙酸色譜峰的影響

實驗過程：分別取樣品約0.02g、0.05g、0.1g、0.2g置于20ml容量瓶中，加適量純化水溶解，各加三氟乙酸儲備液2ml，然后分別定容至刻度，進樣分析（色譜條件同上），結果如下圖。

從圖1中可以看出，當加入樣品的量為0.1g時，三氟乙酸色譜峰的峰形已經略有變化（峰變寬且略有拖尾）；當加入樣品的量為0.2g時，三氟乙酸的色譜峰分叉。

一般來說，只要樣品樣品中各個成分的重量不要過多（通常對于4.6mm內徑的柱子進樣量＜500µg），每個峰帶在柱子內的移動就不會受樣品中其它峰帶的影響。因此，樣品中單個化合物的重量，往往決定了化合物是否會超載，峰形是否改變，而與樣品總量無關。

當加入樣品的量為0.1g時，，主成分的色譜峰為平頂峰，雖然色譜峰超載，但并沒有影響其它組份的分離；當加入樣品的量為0.2g時，三氟乙酸色譜峰的分離受到影響。實質上是樣品和稀釋溶劑組成三氟乙酸的稀釋劑，供試品與溶劑組成的溶液的PH與流動相不同，也就是三氟乙酸在稀釋劑中的電離狀態與流動相中的狀態不同，供試品濃度越大，影響越大。因此可以減少樣品量來解決這個問題。

2、考察不同稀釋劑對三氟乙酸色譜峰的影響

實驗過程：取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，分別加適量純化水、PH3.0流動相、0.1%磷酸溶解，各加三氟乙酸儲備液2ml，然后分別定容至刻度，進樣分析（色譜條件同上），結果如下圖。

從圖中可以看出，在加入樣品量為0.2g時，通過調節稀釋劑對三氟乙酸色譜峰的峰形有所改善。

通常情況下，樣品溶劑比流動相弱，進樣體積不會對峰寬和分離度造成負面影響；相反，樣品溶劑比流動相強時，往往會使色譜圖中較早流出的色譜峰扭曲變形或峰寬加寬。用流動相作為稀釋劑，得到的峰形相對較好，是因為三氟乙酸在稀釋劑和流動相中的電離狀態較為一致；0.1%磷酸作為稀釋劑，三氟乙酸部分質子化，在稀釋劑中的狀態與流動相中的狀態不一致。

3、考察不同流動相PH對三氟乙酸色譜峰的影響

實驗過程：流動相（A）為0.07%磷酸，調節PH為6.0（三乙胺調節）；取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，加適量流動相溶解，各加三氟乙酸儲備液2ml，然后分別定容至刻度，進樣分析（色譜條件同上），結果如下圖。

從圖中可以看出，通過調整流動相的PH可以明顯改善三氟乙酸色譜峰的峰形，主要原因是通過增加流動相的PH減弱主成分對三氟乙酸的影響，增加了化合物與色譜柱之間的作用力，從而增強了色譜柱的篩選作用。其主要原因是流動相中的三乙胺與色譜柱上的固定相作用，然后再與三氟乙酸作用，形成離子對作用，所以圖中三氟乙酸色譜峰保留時間增長，但基線較差，是因為離子對效應，平衡時間短。

4、將0.07%磷酸改為20mM磷酸二氫鉀（PH6.0）

實驗過程：流動相（A）為20mM磷酸二氫鉀，調節PH為6.0（氨水調節）；取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，加適量流動相溶解，各加三氟乙酸儲備液2ml，然后分別定容至刻度，進樣分析（色譜條件同上），結果如下圖。

從圖中可以看出，將0.07%磷酸（PH6.0）改為20mM磷酸二氫鉀（PH6.0）后，三氟乙酸色譜峰仍然分叉（樣品與對照），主要原因是流動相緩沖能力不足引起的。

5、將0.07%磷酸改為20mM磷酸二氫鉀（PH3.0）

實驗過程：流動相（A）為20mM磷酸二氫鉀，調節PH為3.0（氨水調節）；取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，加適量流動相溶解，各加三氟乙酸儲備液2ml，然后分別定容至刻度，進樣分析（色譜條件同上），結果如下圖。

從圖中可以看出，將0.07%磷酸（PH6.0）改為20mM磷酸二氫鉀（PH3.0）后，三氟乙酸色譜峰仍然分叉（樣品與對照），主要原因是流動相緩沖能力不足引起的。

綜上所述，流動相的PH和稀釋劑可以顯著影響色譜峰的峰形，因此在平時實驗中要注意稀釋劑效應和流動相的緩沖容量。

總結 

（1）在整個實驗過程中，樣品始終具有溶劑效應；

（2）調整流動相的PH可以改變樣品進樣量，并且影響色譜峰的峰形；

（3）使用流動相作為稀釋劑可以改善色譜峰的峰形。