概述:

水合肼（結(jié)構(gòu)見圖1）是一種常用的醫(yī)藥中間體，可作為還原劑，參與多種不同類型的藥物的合成。由于反應(yīng)過程中副產(chǎn)物只產(chǎn)生氮?dú)夂退运想率且环N綠色還原劑，工業(yè)應(yīng)用極其常見。

圖1. 水合肼

由中國化學(xué)家黃鳴龍改進(jìn)的基斯內(nèi)爾-沃爾夫-黃鳴龍還原反應(yīng)（Wolff-Kishner）反應(yīng)（見圖2）是水合肼作為還原劑的經(jīng)典人名反應(yīng)，在堿性條件下將醛類或酮類試劑與水合肼作用，醛或者酮羰基被還原為亞甲基，反應(yīng)在常壓下即可完成，反應(yīng)時(shí)先將反應(yīng)物與氫氧化鈉、水合肼和高沸點(diǎn)醇類的水溶液混合加熱，生成腙后，將水和過量肼蒸出，待溫度達(dá)到195～200℃時(shí)回流3～4小時(shí)后完成，其中酮和醛羰基都通過中間體轉(zhuǎn)化為亞甲基或甲基。

圖2. 基斯內(nèi)爾-沃爾夫-黃鳴龍還原反應(yīng)（Wolff-Kishner）

另外，水合肼作為關(guān)鍵的氮源中間體也經(jīng)常在藥物合成中使用，常用作制藥原料。如合成物料氨基尿，該物料用于生產(chǎn)呋喃西林、呋喃妥因、腎上腺色腙，氫化潑尼松、氫化可的松等藥物，也用于測定醛、酮試劑；也可合成物料異煙肼，該物料可用于生產(chǎn)治療結(jié)核病的一線藥物、抗心律失常藥，如呋喃西林鹽酸阿齊利特；除此之外，水合肼可以直接用來合成半合成氨基糖甙類抗生素，如硫酸阿米卡星及生產(chǎn)用做耐藥β-內(nèi)酰酶的抑制劑，如他唑巴坦酸等，同時(shí)水合肼還常用于生產(chǎn)多種農(nóng)藥，如植物生長調(diào)節(jié)劑，落葉劑及除草劑等。

水合肼可對肝、腎、血液等系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用，ICH M7有數(shù)據(jù)顯示，水合肼具有致突變性，通常作為遺傳毒性雜質(zhì)控制。因此，要求藥品中水合肼的殘留量必須低于可接受限度以下。由于水合肼類化合物較活潑，極性較大，通過常規(guī)HPLC色譜柱保留較差，如何快速、簡便、高靈敏地監(jiān)測生產(chǎn)過程中肼的殘留量，一直是目前關(guān)注的重點(diǎn)問題。

常用的檢測方法:

氣相色譜質(zhì)譜檢測法：

目前利用氣相色譜法檢測水合肼一般采用直接和衍生化法。直接法是采用熱導(dǎo)檢測器分析，但其靈敏度低，且水合肼是強(qiáng)堿性化合物，對柱子要求也比較高。衍生化則一般采用2，4-二硝基苯甲醛或乙酰丙酮用作衍生化試劑。有文獻(xiàn)報(bào)道采用丙酮作為衍生化試劑（見圖3），室溫條件反應(yīng)15min，通過頂空-氣相色譜質(zhì)譜法對原料藥中的水合肼含量進(jìn)行了分析檢測，定量限可低至0.1 ng·ml-1。在幾種原料藥的方法學(xué)驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，Std濃度在1 ng·ml-1-20 ng·ml-1的水平上水合肼衍生產(chǎn)物的加標(biāo)回收率在80%和117%之間。6針Std濃度為1 ng·ml-1時(shí)的精密度通常在2.7%至5.6%之間。在1 ng·ml-1-10 ng·ml-1水平的線性曲線Y = 1660.9X−169.42，R2 = 1.0000。

圖3. 丙酮與水合肼的衍生反應(yīng)

液相色譜檢測法：

由于水合肼的弱保留性，通常很難通過高效液相色譜直接檢測，所以水合肼的液相色譜法也是采用衍生化法。衍生試劑一般采用具有強(qiáng)共軛基團(tuán)的醛酮。諾衡生命科技采用2-羥基-1-萘甲醛作為衍生試劑已成功開發(fā)對多個(gè)方法對各種原料藥中的水合肼含量進(jìn)行分析檢測（見圖4），定量限可低至5 ng·ml-1。Std濃度在10ng·ml-1-50 ng·ml-1的水平上水合肼衍生產(chǎn)物的加標(biāo)回收率在80%和120%之間，在1 ng·ml-1-10 ng·ml-1水平的線性曲線Y = 872.14x − 153.4，R2 = 0.9996。

圖4. 丙酮與水合肼的衍生反應(yīng)

液相色譜質(zhì)譜檢測法： 

對于一些靈敏度要求更高，或者溶解性較差的API中水合肼類化合物的含量檢測，諾衡生命科技還建立了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，這些使用各種酰氯作為衍生試劑，符合各種實(shí)驗(yàn)要求，由于篇幅限制，在此不再贅述。

案例:

依魯替尼：

依魯替尼（見圖5）是一種小分子BTK抑制劑，能夠與BTK活性中心的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，從而抑制其活性。2013年11月13日，美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)了依魯替尼可用于套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)的治療。

圖5.依魯替尼的合成路線

依魯替尼常見的合成路線中（見圖5），水合肼作為氮源參與5-氨基-1H-吡唑-4-腈環(huán)的合成。根據(jù)ICH M7要求計(jì)算，對于水合肼的檢測是必要的。作者以水楊酰為衍生試劑，十八烷基為固定相，對伊魯替尼中潛在的遺傳毒性雜質(zhì)水合肼含量進(jìn)行測定，色譜柱尺寸采用4.6 mm * 250 mm，粒徑為5 mm （Inertsil ODS-3V）。流動(dòng)相采用0.02 M正磷酸二氫銨水溶液和乙腈（35:65）。使用等度洗脫模式進(jìn)行分離，流速為1.0 mL /min，柱箱溫度為40℃。檢測的波長為354 nm。所開發(fā)的方法已按照ICH指南進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)具有良好的線性，準(zhǔn)確度和中間精密度，檢測限可低至0.81ppm。溶液在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，該方法可成功用于依魯替尼中水合肼的測定，用于常規(guī)分析和穩(wěn)定性評估。

表1.低、中、高三個(gè)濃度加標(biāo)回收率結(jié)果

表2.中間精密度結(jié)果

表3.線性結(jié)果

總結(jié):

水合肼及肼類化合物常被用作還原劑或者氮源中間體存在于藥物合成過程中，這些物質(zhì)可能會(huì)殘留于終產(chǎn)品中成為雜質(zhì)，對人體器官如眼、上呼吸道產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激作用，并損害肝、腎組織和心肌等，更因其致癌性和致畸變性導(dǎo)致癌癥和遺傳性基因損害的發(fā)生。因此，藥品中如果含有水合肼及肼類化合物殘留，藥品就會(huì)存在質(zhì)量缺陷并對人類健康造成威脅，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的分析方法以控制藥物中水合肼及肼類化合物的含量在人類醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展進(jìn)程中顯得尤為重要。

基因毒性雜質(zhì)最主要的特點(diǎn)是在極低濃度時(shí)即可造成人體遺傳物質(zhì)的損傷，導(dǎo)致基因突變并促使腫瘤發(fā)生。因其毒性很強(qiáng)，對藥物的安全性造成強(qiáng)烈的威脅，行業(yè)中已多次出現(xiàn)由于基因毒性雜質(zhì)控制不合規(guī)，造成上市藥品強(qiáng)行被召回的案例，給企業(yè)造成了巨大的損失。因此，在個(gè)體對自身健康更為重視，審查機(jī)構(gòu)對藥品質(zhì)量合規(guī)性核查更為嚴(yán)格的今天，如何更好的運(yùn)用QbD理念以控制藥品中基因毒性雜質(zhì)的含量并最大程度的降低成本，已成為當(dāng)今企業(yè)的必修課之一。

本文根據(jù)以下文章進(jìn)行編輯整理，僅用于學(xué)習(xí)、交流：

1. Sun, M., Lin, B. , & Liu, D. Q. A generic approach for the determination of tracehydrazine in drug substances using in situ derivatization-headspace gc-ms. JPharm Biomed Anal. 2009, 49(2), 529-533.

2. Rrg, A., Am, A. , Jas, A. , & Sm, B. Determination of potential genotoxic impurityhydrazine hydrate in ibrutinib by rp-liquid chromatography - sciencedirect.2020.

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4. Gionfriddo, E. , Naccarato, A. , Sindona, G. ,& Tagarelli, A. Determination of hydrazine in drinking water: developmentand multivariate optimization of a rapid and simple solid phasemicroextraction-gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometryprotocol. Analytica Chimica Acta. 2014, 835, 37-45.