反相鍵合相色譜法（C18，C8固定相）是目前最常用的一種色譜方法，當采用它進行藥品雜質(zhì)檢查，特別是響應因子較低的雜質(zhì)的檢查時，為了提高方法對雜質(zhì)的檢測能力，通常采用較大的進樣量，這時往往會出現(xiàn)色譜柱對主成分的過載。

按色譜動力學的解釋，過載是由等溫非線性分配引起。色譜理論認為，組分在固定相和流動相中按比例分配，當固定相和流動相一定時，分配系數(shù)只是溫度的函數(shù)。當組分的量在一定范圍內(nèi)時，分配系數(shù)不變，組分在分配固定相中的量（MS）和流動相中的量（Mm）服從線性關(guān)系；當組分的量超過該范圍，分配將偏離線性（等溫非線性分配），色譜柱過載。過載有以下兩種情況：

第一種情況如圖1所示，色譜柱過載后，隨著組分量的增加，k’變小。表現(xiàn)在譜帶上就是濃度越大的區(qū)域遷移越快，表現(xiàn)在色譜圖上就是出現(xiàn)一個呈近似直角三角形的拖尾的色譜峰（過載拖尾）。

第二種情況如圖2所示，色譜柱過載后，隨著組分量的增加，k’變大。表現(xiàn)在譜帶上就是濃度越大的區(qū)域遷移越慢，表現(xiàn)在色譜圖上就是出現(xiàn)一個呈近似直角三角形的前延的色譜峰。

一般在HPLC中第一種情況很常見，以下主要討論過載拖尾的情況。

1.過載拖尾峰的峰型特征和危害

一般呈近似直角三角形，進樣量越大，拖尾越嚴重，保留時間越短。雖然不同進樣量下保留不一致，但色譜峰卻都在同一時間結(jié)束。

由于峰結(jié)束的位置不變，所以這種拖尾峰對其后面的雜質(zhì)分離不會有影響，但卻容易覆蓋前面的雜質(zhì)峰，對它們的分離不利。

2.影響過載的因素及解決辦法

（1）柱容量

柱容量越大越不容易過載。決定柱容量的指標是柱截面上固定相的面積占比，它與空容、填料的比表面積、表面健合率等色譜參數(shù)有關(guān)。

需要注意的是，增加柱長并不能增加柱容量，因為樣品進樣后不可能立即分布于整個色譜柱，同樣因為無限直徑效應的緣故，增大柱內(nèi)徑也不能增大柱容量。

（2）進樣量

顯然，減小進樣量可以緩解過載，有時還能夠達到分離雜質(zhì)的效果。

如圖4所示，進樣量減小一半，主成分前相鄰雜質(zhì)峰從主成分峰中分離出來，但方法對雜質(zhì)的檢出能力也隨著降低。

（3）組分分配到固定相中的量

柱容量一定時，分配到固定相中的量越少，保留越小，柱越不容易過載。理論上，在固定相中不分配時，組分不保留，再大的進樣量也不會出現(xiàn)過載。對于C18/C8健合固定相，可以通過增加有機相比例減小組分在固定相中的分配來緩解過載，當然，隨著有機相的改變，方法選擇性也會發(fā)生變化。

圖5中，有機相比例增加，保留減小，過載緩解，拖尾因子減小。

（4）組分的存在方式

對于易解離組分如酸堿性物質(zhì)，在流動相緩沖容量足夠的情況下，譜帶上任一點解離型（離子）和非解離型（分子）的比例始終一致，離子型和分子型相伴以恒定的比例流出色譜柱，出現(xiàn)的色譜峰是離子型和分子型的疊加。

如果其中一個組分過載，表現(xiàn)出一個拖尾的色譜峰，另一組分雖未過載，但由于上述原因，也會表現(xiàn)為和過載組分形狀一致大小不同的過載峰。因此易解離組分的峰型由過載的那一種存在方式?jīng)Q定。

一般離子型比分子型組分更容易過載，故易解離組分的過載由離子型的過載決定，過載程度與其占比有關(guān)。一般通過調(diào)整流動相pH抑制組分解離可大大減小離子型比例，緩解甚至消除過載。

對于強酸/堿性物質(zhì)，難以通過調(diào)節(jié)pH抑制解組分的解離，這個時候可以通過形成離子對復合物來減小離子型占比以緩解過載。同樣地，過載由離子型決定，形成的離子對復合物越多，離子型就越少，過載就越能得到緩解。

更復雜的情況是既抑制解離又存在離子對試劑的時候，這個時候可以通過上述兩方面來改變離子型的占比，既可以緩解過載拖尾，又可以調(diào)整保留。情況雖然復雜，但手段卻更加靈活多樣。

（5）鹽的濃度

對于離子型組分在C18/C8固定相上易于過載的原因，主要是因為離子型組分一旦進入固定相以后，離子間的排斥作用會阻止組分的進一步進入。

我們通常使用緩沖鹽主要是為了維持流動相有足夠的緩沖容量，但另一方面緩沖鹽甚至是中性鹽的加入還可以增加流動相離子強度，部分屏蔽組分離子間的相互排斥作用，減輕過載。同時鹽還可以與離子組分形成離子對復合物，降低組分離子型比例來緩解過載。鹽濃度越大，效果越明顯。

以下以某一堿性化合物為例，通過實驗探討鹽對過載行為的影響。該化合物含一個疏水性較強的芳香基團和一個伯氨基，堿性較強，pKa為9.9，在試驗所用流動相pH下幾乎全部以解離型存在。以下所有試驗流動相緩沖液pH均用磷酸調(diào)節(jié)到2.5；流動相中有機相均為乙腈，除圖中標出乙腈比例外，均為緩沖鹽：乙腈=80：20；柱溫30℃；測試波長210nm；色譜柱為AgilentSB-C18（4.6*150mm，5um）；供試品濃度為1mg/ml；進樣體積為10uL。

圖7表明，隨著緩沖鹽濃度的增加，過載得以緩解，峰拖尾因子逐漸減小。即使加入中性鹽硫酸鈉，也能起到相似作用。

圖8中50mmol/L的硫酸鈉起到比100mmol/L磷酸二氫鉀更好的緩解過載拖尾的效果，因此50mmol/L的硫酸鈉離子強度更大的緣故。

圖7中三個色譜峰沒有在同一時間結(jié)束，說明隨著緩沖鹽濃度的增加，容量因子發(fā)生變化。圖中可以看出，鹽濃度越大，容量因子越大，說明組分與緩沖鹽中磷酸二氫根陰離子形成了保留更強的離子對復合物。唯一令人費解的是，圖7中使用50mmol/L的硫酸鈉時容量因子沒有如愿增加。

緩沖鹽與離子型組分形成離子對復合物所占比例到底有多少一直是筆者想知道的一個問題。其比例可以通過下式進行計算：

k’=x離子型﹒k’離子型+x離子對型﹒k’離子對型

x為各存在方式的占比，k’為相應的容量因子。

離子對復合物的保留應與分子型的保留相當，考慮到組分堿性較強，要測定組分分子型的保留值，需要完全抑制組分解離，流動相pH需要高達12以上，這在普通的C18柱上難以實現(xiàn)，故以伯氨基被酰胺取代的化合物代替該物質(zhì)的分子型，并以此測得的保留值作為離子對復合物的保留值來及計算k’離子對型。

k’離子型用緩沖液鹽濃度最低時（5mmol/L）的k’代替。

各緩沖液濃度下組分色譜峰均存在不同程度過載拖尾，故保留時間以色譜峰結(jié)束時的時間估算，應不至于產(chǎn)生太大誤差（其實應于各條件下取低濃度組分進樣，色譜峰不至于過載，能獲得組分的準確保留值）。

由此可見，即使緩沖鹽濃度高達100mmol/L，緩沖鹽中磷酸二氫根陰離子與組分陽離子形成離子對復合物的比例仍不及1%。

一般離子極化能力越強，水合離子半徑越大，形成離子對復合物能力也越強。PF6—與

ClO4—以其強大的極化能力和較大的水合離子半徑使其在所有陰離子對試劑中在形成離子對能力方面名列前茅。一般PF6—＞ClO4—＞＞其他陰離子。

圖9中采用六氟磷酸鉀比采用相同濃度的高氯酸鈉有更強的保留，顯示PF6—比ClO4—更強的形成離子對復合物的能力,相應地前者比后者更大程度的緩解了過載，拖尾因子也較低。

圖10中55.8min的為酰胺取代物的保留值，用它代替離子對復合物的保留值，計算出50mmol/L高氯酸鈉和50mmol/L六氟磷酸鉀與組分形成離子對復合物的比例分別為9.2%和22.7%。

既然過載由離子型引起，那就可以增加流動相中乙腈比例，減小離子型在固定相中的分配來減輕甚至消除過載。圖11是將流動相中乙腈比例增加到40%，此時幾乎全部以離子型存在的組分在固定相中幾乎不分配，色譜圖也沒有顯示出過載特征（T=1.11）。

然而不（低）分配也意味著不（低）保留，為了使主份有一定保留，可通過添加離子對試劑實現(xiàn)。圖11添加50mmol/L高氯酸鈉即使組分實現(xiàn)保留，同時色譜峰拖尾因子仍與幾乎不保留時一致，進一步證明過載由離子型引起，緩解了離子型的過載就緩解了整個色譜峰的過載。

高乙腈比例使離子型組分在固定相中不分配以消除過載拖尾，添加離子對高氯酸鈉來實現(xiàn)組分的合適保留是以上我們用到的方法。為了到達更強的保留，我們還可以使用帶有不同碳鏈的烷基磺酸鹽/硫酸鹽類疏水性離子對試劑。如使用庚烷磺酸鈉等。這類離子對試劑由于其形成離子對復合物能力很弱，加之使用濃度一般都很低（零點幾到數(shù)個mmol/L），故形成的離子對復合物濃度很低，難以有效降低離子型組份的占比，對緩解過載幾無貢獻。但因為長的碳鏈的緣故，其形成的為數(shù)不多的離子對復合物的k’甚至遠大于分子型組分的k’，故可以很好的延長組分的保留。

對于這類離子對試劑的保留機理，相比于高氯酸鈉和六氟磷酸鉀，由于其強的疏水性，除了上述形成離子對復合物的外，還存在一種所謂“動態(tài)離子交換”保留模式，即離子對試劑分布在C18上形成帶有陽離子交換功能基的另一種動態(tài)的固定相，對陽離子組分有類似離子交換的保留作用。該離子交換的有效柱容量與流動相中有機相比例有關(guān)，因流動相中有機相與離子對在固定相上的分布存在競爭關(guān)系，流動相中有機相中有機相比例越大，分布在C18上的離子對越少，離子交換的有效柱容量越低。

組分在這種離子對試劑模式下的過載除了離子型在C18過載外，還包括離子型在所謂“離子交換固定相”上的過載。緩解或消除這兩種過載的簡單有效的方式是流動相中采用高有機相比例減少離子型組分在C18固定相上的分配，同時流動相中采用高鹽濃度減少離子型組分在“離子交換固定相”上的分配。

圖12兩個色譜峰流動相均采用 40%乙腈，此時離子型組分在C18固定相上的過載基本被消除，流動相鹽的濃度為5mmol/L時過載拖尾明顯，蓋因離子型在“離子交換固定相”上的過載所致，流動相鹽濃度增加至50mmol/L時拖尾明顯緩解。

更長碳鏈的離子對試劑的使用一直是個麻煩！如十二烷基硫酸鈉，因為很容易導致峰型畸形。

圖13水相中均還含有5mmo/L十二烷基硫酸鈉，緩沖鹽濃度高達100mmol/L峰型才達到正常，分析原因，可能是長碳鏈的離子對在C18上分布時容易引起取向混亂，導致形成“離子交換固定相”的硫酸鈉基團在C18上分布不均引起。增加流動相中鹽濃度能減弱甚至消除離子交換作用，使這種不均一的“離子交換固定相”的保留作用減小直至消除。

（6）梯度洗脫

在梯度洗脫過程中，一方面隨著流動相有機相比例逐漸增加，組分在固定相中的分配也逐漸降低，過載的累積也就逐漸減輕。另一方面，對于低有機相比例洗脫時組分已經(jīng)形成過載峰這一既定事實，梯度洗脫特有的所謂“譜帶壓縮機制”也可以進行部分“逆轉(zhuǎn)”。我們知道，對于過載的譜帶，組分濃度沿著柱入口到柱出口方向逐漸增加，而高有機相比例的流動相總是首先到達靠近柱入口的低濃度組分譜帶區(qū)域，使它們不停追趕靠近柱出口的高濃度組分，最終使譜帶壓縮，以前過載拖尾的峰型得到緩解。