目的：確認無菌檢查試驗所需物品經無菌隔離器系統滅菌后達到預期的滅菌效果要求。

方法：通過過氧化氫氣體濃度及分布狀態確認、BI 挑戰試驗、選擇性微生物挑戰試驗及隔離器內部環境的微生物檢測（沉降菌、浮游菌、表面微生物）驗證無菌隔離器的最終滅菌效果。

結論：無菌隔離器經過過氧化氫蒸汽滅菌后，艙體內物品表面的微生物被殺滅，物品內部的微生物均不受影響且過氧化氫殘留對微生物無影響，無菌隔離器的系統滅菌效果達到預期要求。

無菌檢查隔離器( 也稱實驗室隔離器，sterility testing isolator) 是為無菌檢查試驗提供無菌環境的一種設備，它能較好地防止微生物污染待測樣品，可以避免試驗用物品和輔助設備被污染，提高了無菌檢查試驗結果的準確性，現已在全球制藥行業得到廣泛應用。

目前無菌檢查隔離器的滅菌通常是采用過氧化氫蒸汽滅菌劑來進行。在隔離器內部集成有過氧化氫發生器，可將高濃度的過氧化氫溶液經發生器轉化為氣態，均勻分布在隔離器艙體內，在一定濃度及時間的條件下進行滅菌，并在滅菌完成后利用帶高效過濾器的通風系統將艙體內殘留的過氧化氫蒸汽排出分解達到最終的滅菌效果。無菌檢查隔離器滅菌完成后艙體內部環境的微生物負載應達到GMP 規定中A 級潔凈度的要求，且滅菌過程不對物品內及試驗樣品的微生物有影響。

無菌檢查隔離器的系統驗證是保證無菌檢查所需無菌環境的必要條件，而無菌隔離器的滅菌效果驗證更是整個系統驗證中尤為重要的驗證項目之一。無菌隔離器的滅菌效果評價不僅包括滅菌對物品表面的滅菌效果評價，還包括滅菌對物品及待測樣品內部微生物的影響程度評價和滅菌殘留物對物品及待測樣品微生物的影響程度評價。本文就無菌隔離器在最大裝載量下的滅菌效果進行詳細的驗證研究。

1 、材料與方法

1.1 材料

STI-2400D 型無菌隔離器，供應商為杭州泰林生物技術有限責任公司；過氧化氫蒸汽化學指示劑；過氧化氫蒸汽滅菌生物指示劑；過氧化氫溶液，各種檢測用培養基及實驗菌株等材料。

1.2 方法

（1）菌懸液的制備。

①取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物用0.9% 無菌氯化鈉溶液制備成每1ml 含菌數小于100cfu 的菌懸液15ml；菌懸液平均分裝于3 小藍蓋瓶內，瓶口密封（包裝形式與無菌檢查供試品一致），2 ～ 8℃冰箱存放，24h 內備用。

②取白色念珠菌的新鮮培養物用0.9% 無菌氯化鈉溶液制備成每1ml 含菌數小于100cfu 的菌懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝及保存。

③取黑曲霉的新鮮培養物加入3 ～ 5ml 含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后取孢子懸液至無菌試管，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數小于100cfu 的孢子懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝，2 ～ 8℃冰箱存放，2 月內備用。

（2）無菌隔離器的準備。以無菌隔離器最大裝載量的要求將無菌檢查所需物品擺放到無菌隔離器內部相對應的位置；無菌隔離手套及艙體密封性測試合格；運行參數已確認。

（3）過氧化氫氣體濃度及分布狀態確認。取19 支過氧化氫蒸汽化學指示劑編號，放入無菌隔離器的手套部位、進出風口、風扇背部、艙體上下四角及垃圾桶底部，滅菌完成后觀察變色情況。

（4）BI 挑戰實驗。取13 支過氧化氫滅菌生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢菌片）分布于無菌隔離器的8 個手套部位、左右艙門、艙體操作臺面的左右及垃圾桶底部，滅菌完成后菌片取出接種于胰酪大豆胨液體培養基中，56℃培養，培養7 天，觀察培養物的生長情況，同時取未經滅菌的生物指示劑3 片同法接種，作為陽性對照。

（5）無菌隔離器開啟滅菌。開啟無菌隔離器的自動運行程序，依次按照“自動除濕”、“自動調節”、“自動滅菌”、“自動通風”、“自動保壓”五個階段完成運行程序。

（6）沉降菌檢測。取胰酪大豆胨瓊脂平皿培養基15 個，擺放在隔離器艙體操作臺面上，臺面兩側各放置6 個平皿，臺面左右兩側各放置1 個平皿，垃圾桶底部放置1 個平皿。平皿暴露采樣4 小時，同時取3 只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20 ～ 25℃培養箱中培養72 小時后，再轉入30 ～ 35℃培養箱中培養48 小時，記錄培養皿中菌落數量。

（7）浮游菌檢測。取樣點為隔離器操作平臺的左右各1 個點，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿，在取樣點工作區附近放置取樣器，進行空氣取樣，各取樣點的取樣量為1000 升，同時取3 只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20 ～25℃培養箱中培養72 小時后，再轉入30 ～ 35℃培養箱中培養48 小時，記錄培養皿中菌落數量。

（8）表面微生物的檢測。取胰酪大豆胨瓊脂接觸碟培養基6 個分別對隔離器艙體內表面的上部、下部、左部、右部、前部、后部進行接觸10 秒采樣；取胰酪大豆胨瓊脂接品平皿培養基（TSA）分別對8 個手套指模進行取樣，同時取3 只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20 ～25℃培養箱中培養72 小時后，再轉入30 ～ 35℃培養箱中培養48 小時，記錄培養皿中菌落數量。

（9）選擇性微生物挑戰試驗。

①試驗組一：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經無菌隔離器過氧化氫蒸汽滅菌，接種計數。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml 接種于TSA 上，平行接種兩次，30 ～ 35℃培養48 ～ 72 小時，菌落計數，取平均值；取白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1ml 接種至沙氏葡萄瓊脂培養基上，平行接種兩次，30 ～ 35℃培養3 ～ 5 天，菌落計數，取平均值。

②試驗組二：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經無菌隔離器過氧化氫蒸汽滅菌，并在滅菌完成后拆開菌懸液瓶口，使內容物在無菌隔離器內暴露5min，然后同試驗組一同法接種計數。陽性對照組：取保存在冰箱內同批制造的選擇性微生物菌懸液，同試驗組一同法接種數。

陰性對照組：另取0.9% 無菌氯化鈉同法接種于TSA 及沙氏葡萄瓊脂培養基上，作為陰性對照組。

2、 結果及分析

2.1 過氧化氫氣體濃度及分布狀態確認結果

結果顯示編號1 ～ 19 的過氧化氫蒸汽化學指示劑均由綠色變為黃色，且各指示條變色后顏色基本一致，無肉眼可見的顯著性差異。表明過氧化氫氣態濃度在隔離器艙體內均勻分布，且達到滅菌濃度。

2.2 BI 挑戰實驗結果

試驗結果顯示編號1 ～ 13 的過氧化氫滅菌生物指示劑接種于TSB 中培養7 天后培養基無渾濁，無菌生長；陽性對照組培養7 天后培養基渾濁，有菌生長。表明無菌隔離器經過滅菌后能殺滅106 個cfu的嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.3 沉降菌檢測結果

結果顯示無菌隔離器內部各采樣點的沉降菌菌落數均為0cfu/ 皿。表明滅菌后的無菌隔離器內部環境達到A 級潔凈度下沉降菌的相關規定。

2.4 浮游菌檢測結果

隔離器操作平臺的左右各1 個點的浮游菌最終菌落數均為0cfu/ 皿。表明滅菌后的無菌隔離器內部環境達到A 級潔凈度下浮游菌的相關規定。

2.5 表面微生物檢測結果

表面微生物檢測結果顯示無菌隔離器內部各采樣點的表面微生物菌落數均為0cfu/ 皿。表明滅菌后的無菌隔離器內部環境達到A 級潔凈度下表面微生物檢測的相關要求。

2.6 選擇性微生物挑戰試驗結果

結果顯示試驗組一的回收率依次為95.8%、94.7%、97.0%、94.3%、95.5%， 均在90% 以上；試驗組二的回收率依次為92.9%、92.0%、95.5%、96.2%、97.0%，均在90% 以上。見表1 和表2。

結果表明：

①無菌隔離器的滅菌過程未對物品內部微生物造成影響，即過氧化氫蒸汽滅菌不會殺滅現有包裝形式的物品及供試品內部的微生物。

②無菌隔離器艙體內的過氧化氫殘留對微生物無影響。

3 、討論

本試驗通過布點化學指示劑對過氧化氫蒸汽濃度分布狀態進行監測，確認了無菌隔離器內的滅菌劑是均勻分布的，且達到了滅菌所需有效殺滅濃度；通過布點生物指示劑對過氧化氫蒸汽殺滅物品表面微生物的效力進行檢測，確認了無菌隔離器的滅菌對表面微生物的殺滅是有效的；進而通過對滅菌后的無菌隔離器進行內部環境的浮游菌檢測、沉降菌檢測及表面微生物檢測確認了滅菌后無菌隔離器能達到A 級潔凈級別要求下的微生物水平；最后通過選取一些具有代表性的標準菌株，制成菌懸液，模擬試驗樣品在無菌隔離器內的整個過程。滅菌完成后，分暴露與不暴露兩種狀態，分別對各選擇性菌株的菌懸液進行培養計數，計算回收率，以此來確認了無菌隔離器的滅菌過程不會對物品內部的微生物造成影響，以及無菌隔離器滅菌完成后的過氧化氫殘留亦不會對微生物造成影響。綜合分析得以證明無菌隔離器現有滅菌程序的有效性。各試驗重復進行3 次可驗證滅菌程序具有良好的重復性或重現性。通過本試驗，為無菌隔離器的滅菌效果驗證提供一種具體可行且設計優化的研究手段，能全面評價無菌隔離器的滅菌效果。