有關物質的研究貫穿于藥品研發過程的始終，是評價藥物的安全性、仿制藥與原研上市產品質量一致性的重要指標。目前最常用的方法是高效液相色譜法（HPLC）法。與常規產品檢驗不同的是，藥品研發中的有關物質測定的目的，除了將結果與質量標準限度相比以判斷產品合格與否之外，更多是用于處方工藝選擇、藥物雜質譜的分析，穩定性的評價等，需要特別強調雜質數據之間的“對比”，關注的是雜質的變化量和變化規律，因此雜質數據的準確、重現、連貫顯得尤為重要。

本文從對有關物質的色譜條件設計和測定操作兩方面的影響因素進行分析，探討采取可行的方法，最大程度地減少誤差，提高有關物質測定數據的準確性、重現性、可比性，提高藥品研發中雜質研究的質量。

1、  基線與溶劑峰

梯度洗脫因其具有在較短時間內有效分離極性相差懸殊的系列物質、改善峰形、提高檢測靈敏度等優勢，而在雜質研究中廣為應用，呈現出逐步取代等度洗脫的趨勢。但基線波動或漂移是梯度洗脫中常見的問題，基線波動產生不確定的微小噪音信號，疊加在雜質峰中，會使雜質“增大”。此外，梯度洗脫易在每一針運行的中后部產生溶劑峰，并且毎針之間溶劑峰的大小還不易重現，這將導致在該保留時間范圍內出峰的雜質被掩蓋，且無法采取扣除溶劑峰的辦法解決。而等度洗脫因洗脫強度始終保持一致，很少出現上述問題。引起基線波動與溶解峰的原因與以下因素有關。

1.1試劑的純度   試劑中的雜質與污染物，會隨著梯度中的有機相比例的增大，先富集在柱頭后被洗脫出來，因此配制流動相所用試劑應采用HPLC級別或高純度的試劑，并在開瓶后妥善貯存，避免污染。

1.2流動相使用時間   配好水浴緩沖鹽溶液易受微生物污染，同樣產生上述問題，故純水洗流動相應新配新用，一般使用時間不應超過48h。

1.3 流動相的配制方法  為方便起見，操作者用用A為純水相，B為純有機相，由色譜泵進行混合形成梯度。這樣有可能因兩性差異大，在線混合時產生微小氣泡造成基線波動，此時應換為A相配成梯度的起始濃度，B相配制成梯度最終濃度，再換算并調整梯度時間表使之與梯度相同，因兩相均同時含有水相與有機相，混合時相容性會更好，基線會更加平穩。

1.4 上一針沒完全洗脫的雜質干擾   這種情況下，通常發現在本次運行中，形成明顯較寬的“鬼峰”，因此在梯度設計時，流動相應達到足夠的洗脫能力，運行時間應足夠長，保證雜質在每一針內能被全部洗脫。

1.5  梯度的重現性   梯度的起始流動相比例與終點不同，而系統因死體積的存在會產生“滯后”效應，并非在所設的時間立即能達到對應的流動相比例，因此在每一針之后，必須運行一個“倒梯度”回到起始比例，并平衡5min，才能保證梯度的重現性。最好的做法是將這一部分“倒梯度”直接設計色譜條件的梯度時間表內。

2、 進樣設計與操作

2.1 進樣量   進樣量是進樣濃度與進樣體積的乘積。進樣量決定了信號的高低，從而影響靈敏度。進樣量決定了信號的高低，從而影響靈敏度。因為進樣體積過大易引起色譜峰的展寬甚至變形，對低濃度信號幫助不大，所以通常設計5~20ul。故在色譜條件設計中，進樣濃度決定了檢測的靈敏度，雜質的信號越高，受到基線噪音波動的影響程度就越小，而與檢測限接近的雜質，顯然稍有基線波動，其值的相對變化量較大。

根據相關指導原則的要求，最低檢測限不得大于該雜質的報告限度，有關物質進樣最低濃度應設定為：檢測限對應的主成分濃度除以報告限。

需要注意的是，供試品濃度并非越高越好，過于大的進樣量，會影響主成分與相鄰雜質的分離度，產生峰拖尾變形、色譜柱過載等問題。同時還有考慮所設計的高濃度下，主成分是否能夠溶解完全。

為了方便操作，許多質量標準的設計中偏好將有關物質與含量測定共同用一份供試品濃度。但是，由于雜質檢測的目標是雜質，而含量測定的對象是主成分，兩者的量相差達2~3個數量級，共同的結果是：或者達不到雜質測定的靈敏度，或者主成分含量測定的濃度過大，線性關系不好，損害柱子的壽命。因此，將有關物質與含量共同一個供試品是欠妥的。

事實上，靈敏度在不同的色譜儀器上會有差異，更為科學的做法是在系統適用性試驗設計靈敏度測試，同時允許調整進樣量達到雜質檢測要求的靈敏度。

2.2進樣濃度的一致性  對于一般檢測，沒有必要也做不到每份樣品的濃度絕對一致，允許稱樣量在±10%甚至更寬范圍變動，這也是方法學驗證中設定“范圍”的目的。在有關物質檢驗中，由于積分時設定了報告限（最小峰面積），有些雜質的量剛好就在報告限（假設為0.05%）附近，如果稱樣量稍小一點，峰面積剛好在設定的最小峰面積之下，該份樣品就“未檢出”該雜質，如果稱樣量稍大一點，該雜質峰就剛好能夠被積分（其值為0.05%），這樣就會導致即使是同一個均一樣品，其雜質數據從0到0.05%沒如果數個單一雜質都如此，總雜質量也會有明顯的變化。因此，為保證新藥研發中有關物質數據的可比性，供試品的稱樣量不能過于隨意，應盡量保持在較小的范圍內，如±2%。

2.3  進樣順序  高濃度樣品運行完成后，常會在系統中有殘留。按有關物質操作要求，每一份樣品通常是先進主成分1%自身對照溶液，再取供試品進樣，到下一份樣品又先進對照液，如此高低濃度地往復循環，低濃度的自身對照溶液常易受到前一針高濃度樣品殘留的干擾，峰面積變大，導致雜質計算結果偏低。

2.4 異常情況 每天開機運行的第一針供試品常會出現雜質偏高的異常情況，原因不明。應運行多次空白梯度后再進樣，如果仍有這種現象，應與后面的平行樣品對比后，舍去該針數據。

3 、積分與色譜圖處理

積分參數選取不當，會漏掉一些雜質峰，或將微小的基線波動或漂移計入雜質的面積中，造成雜質數據的變化，直接影響數據的準確性。

初始積分參數為斜率、峰寬、最小峰面積與最小峰高。對峰面積大小有實質影響的積分參數是斜率與峰寬，斜率越大，峰的起落點越高，峰面積越小，反之亦反；峰寬通常設為所需的最窄峰的半高峰寬，過小會將噪音視作雜質峰，過大易使相鄰的兩小峰合并視為同一個峰積分。而最小峰面積與最小峰高為過濾性參數，即低于其值的峰不被積分，因此最小峰面積應設為雜質報告限所對應的峰面積。

選定合適的積分參數后，應固化積分方法，由色譜工作站自動進行圖譜處理。但如果個別雜質仍由于偶然的基線波動或其他干擾明顯積分不當時，采取手動方式調整積分的做法也是必要的。

4 、色譜系統

4.1色譜柱   在新藥研發過程對于有關物質檢測，在選擇了分離效果最合適的色譜柱后，應固定專用于該項目，更換新柱時也應選擇同一品牌的同一型號，否則，雜質峰的位置不易對應，自然也不利于雜質的對比。色譜柱在使用一段時間后，分離性能下降，有可能會將原沒超過最小積分面積的兩個緊鄰小雜質合并為一個峰，從而被積分，從數據上看會導致雜質增加的現象，解決方法是清洗活化色譜柱，如不能恢復，則應更換新色譜柱。

4.2  洗針液   某些色譜儀的洗針液是重復使用的，如此產生的微量殘留，對于常量檢測的影響微不足道，但會明顯干擾微量的雜質檢測，因此需要經常更換新鮮的洗針溶液。

5  、結語

藥品的質量來源于設計與生產過程，同樣，雜質檢測結果的“質量”也來源于分析方法的合理設計、實驗過程的嚴謹操作。為得到準確、重現的雜質研究數據，藥品質量研究人員應學會設計和甄別分析方法的合理性，領會方法學驗證各指標設置的目的，提高實驗操作水平，并在觀察到異常現象后，分析其產生的原因，從而找到解決的方法。