培養(yǎng)基的制備

 

正確制備培養(yǎng)基時微生物檢驗的最基礎步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分，尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應遵守良好實驗室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。培養(yǎng)基的不正確制備會導致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題。

 

使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時，應嚴格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關數(shù)據(jù)，如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。

 

使用各別成分制備培養(yǎng)基時,應按照配方準確配制,記錄所有細節(jié)信息,如;培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質(zhì)含量、制造商、批號、pH、培養(yǎng)基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。

 

1.水

 

除特定要求,實驗室用水的電導率在25℃下應不高于25uS/cm(相當于電阻率≥0.4MΩcm)。

 

微生物污染應不超過103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。應根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。

 

2.稱量和復水

 

稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊)后再加水至所需的量。

 

3.溶解和分裝

 

脫水培養(yǎng)基加水后適當加熱,并不攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應浸泡幾分鐘。

 

4.pH的測定和調(diào)整

 

用pH計測定pH,必要時在滅菌前調(diào)節(jié)pH，除特殊說明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L(約1mol/L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。如果滅菌后調(diào)節(jié)pH，溶液需滅菌。

 

注:商品化培養(yǎng)基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調(diào)節(jié)pH。

 

5.分裝

 

將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當?shù)娜萜髦校萜鞯捏w積至少為體積的1.2倍。

 

6.滅菌

 

①概述

 

培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。

 

有些培養(yǎng)基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養(yǎng)基對光和熱特別敏感，應在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見相關標準或生產(chǎn)廠商的使用說明）。

 

②濕熱滅菌

 

濕熱滅菌在高壓鍋或培養(yǎng)基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養(yǎng)基的體積超過1000mL，要對滅菌條件進行適當?shù)恼{(diào)整。所有操作均要按照標準和使用說明的規(guī)定進行。

 

注：大容量培養(yǎng)基（＞1000mL）滅菌時可能會造成過度加熱。

 

加熱后應采取適當?shù)姆绞嚼鋮s，防止沸溢。這對大容量培養(yǎng)基和敏感性培養(yǎng)基（如含亮綠的培養(yǎng)基）是非常重要的。

 

③過濾滅菌

 

過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預消毒設備。

 

一些濾膜上附著蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如抗生素)。為達到有效過濾,應事先將濾膜用無菌水潤濕。

 

④監(jiān)測

 

應對經(jīng)濕熱或過濾滅菌的培養(yǎng)基進行監(jiān)測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監(jiān)測。

 

7.添加劑的制備

 

制備含有有毒物質(zhì)(特別是抗生素）時應小心操作，避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發(fā)生其他不良反應。采用適當?shù)念A防措施并小心按照產(chǎn)品使用說明操作。不要使用過期的試劑；抗生素工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關資料，也可由使用者自行測定。

 

培養(yǎng)基配制中的常見問題

 

1.培養(yǎng)基的pH什么時候測？用什么測？怎么測？

 

答：對于培養(yǎng)基應該滅菌前測定和調(diào)整，滅菌后在測定，如果范圍超出正負0.2則培養(yǎng)基品質(zhì)不良。

 

2.滅菌后的培養(yǎng)基是否都要測pH值？如何測定pH值？

 

答：每個制備批次的培養(yǎng)基都應測定pH，可采用pH試紙或pH計測量。

 

3.稀釋液滅菌后pH值是否有變化？有何影響？（如pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液）

 

答：一般pH有下降現(xiàn)象，約0.2左右，不同培養(yǎng)基pH變化可能不同。

 

4. 孟加拉培養(yǎng)基是否可以取代玫瑰紅鈉瓊脂進行培養(yǎng)霉菌和酵母菌？

 

答：根據(jù)中國藥典，采用玫瑰紅鈉瓊脂。

 

5. 配制PH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液時有時因為高壓滅菌器滅菌過程溫度過高而導致培養(yǎng)基混濁了，這種情況緩沖液還能用嗎？

 

答：建議按正常溫度滅菌，混濁培養(yǎng)基建議不要使用。

 

6.含瓊脂培養(yǎng)基在冷藏中形成冰晶怎么處理？銷毀還是加熱再用？

 

答：建議不要使用。

 

7.融化的培養(yǎng)基為什么不能再冷水中冷卻？

 

答：防止受熱不均引起結(jié)塊。

 

8.滅菌后，滅菌鍋需自然冷卻降壓才可以打開，這段時間是否會造成過度滅菌。

 

答：自然冷卻過程已經(jīng)計算在正常滅菌時間內(nèi)了，不會造成過度滅菌。

 

9.培養(yǎng)基所用器具若使用濕熱滅菌，是否必須待干燥后才可以使用？若烘干或其它方法，中間過程怎樣防止微生物污染？

 

答：如果是馬上使用且不是用于非水溶性供試液的制備及實驗，不一定要烘干；否則，應干燥后使用，滅菌及干燥盡量在同一鍋里進行，或用紗布和牛皮紙包扎緊密。

 

10.培養(yǎng)基的避光儲存，是否配置好的培養(yǎng)基其全部放避光儲存？

 

答：最好都避光保存。無條件時，光敏感的培養(yǎng)基一定要。

 

11.商品培養(yǎng)基干粉說是加蒸餾水溶解，實際操作是否可以用純化水或注射用水？

 

答：只要不含有任何可能抑制或影響微生物生長的物質(zhì)的水均可。

 

12.培養(yǎng)基及器具滅菌可否同一設備同滅菌時間進行滅菌？

 

答：最好分開滅菌，條件不允許時可同爐滅菌，前提是都是潔凈無污染的。

 

13.培養(yǎng)基的保溫能否用60℃的培養(yǎng)箱，它與45℃—55℃水浴鍋保溫方法有何不同？

 

答：可以用恒溫培養(yǎng)箱保溫，但保溫溫度一般是50℃左右，且時間不能過長，一般是不超過4小時。

 

14.培養(yǎng)基的貯存是否需要放置于2-10℃冰箱內(nèi)？

 

答：需冷藏保存的培養(yǎng)基外包裝上會寫明。

 

15.培養(yǎng)基滅菌后成份會有所蒸發(fā)減少，如何處理這個問題？

 

答：正常情況下蒸發(fā)量較少，可忽略不計。

 

16.培養(yǎng)基融化后出現(xiàn)渾濁是有哪些方面的原因引起的？應如何避免？

 

答：可能的情況有

 

1.培養(yǎng)基配置用水不符合規(guī)定；

 

2.滅菌過程溫度升溫慢或降溫慢；

 

3.培養(yǎng)基儲存不當；

 

4.融化時沸騰時間較長等。

 

17.準備好的培養(yǎng)基有效期如何驗證？

 

答：定期取出培養(yǎng)基驗證其無菌性，促生長能力等方面。

 

18.培養(yǎng)基配制好滅菌后，在高壓容器中保溫降至50℃左右，可不可行？

 

答：建議最好不要，避免過度受熱。

 

19.脫水培養(yǎng)基對濕度是否有要求？多少適宜？

 

答：按要求室溫干燥環(huán)境儲存即可。

 

20.培養(yǎng)基pH值測定溫度在25℃，這個溫度應怎么控制？比如固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用過程中還能調(diào)節(jié)pH值嗎？

 

答：可水浴控制培養(yǎng)基溫度。

 

21.配制培養(yǎng)基過程中，按說明書稱定量，加規(guī)定的純化水，煮沸溶解，為了避免煮沸過程總減少水分，是否要在配制過程適當增加水?比如陪硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。

 

答：可適量增加，自己掌握。

 

22.商品培養(yǎng)基一定要當天配當天用嗎？可否在一周內(nèi)用完？

 

答：不是即配即用的培養(yǎng)基的話，儲存得當，可以使用。

 

23.稱量培養(yǎng)基時，注意不要吸入粉末，這粉末是指何物？

 

答：就是你所稱量的干粉培養(yǎng)基 ，因為培養(yǎng)基的粉末對呼吸道有刺激作用，而且培養(yǎng)基中的某些成分，如亞硒酸鹽、疊氮化鈉、乙酰胺等，長期吸入并在體內(nèi)累積到一定量會對人體健康有危害。所以培養(yǎng)基配制稱量需做好個人防護，且最好選擇少粉塵環(huán)保型顆粒培養(yǎng)基。

 

24.煮培養(yǎng)基，用不銹鋼鍋在電磁爐上煮可行？硫乙醇培養(yǎng)基是否要煮沸？如何煮沸？用不銹鋼鍋在電磁爐上煮沸可行嗎？可不可以水浴煮沸呢？

 

答：硫乙醇應煮沸，量大時，我實驗室用不銹鋼鍋在電磁爐上煮沸。不建議水浴煮沸，因為水浴煮沸瓊脂粉很難溶，導致瓊脂分裝不均勻，前段分裝的瓊脂含量少，后段分裝的瓊脂含量高，導致有的管或瓶中的凝固。

 

25.如培養(yǎng)基在高壓滅菌器中溫度需自然下降20度才開蓋嗎？

 

答：高溫滅菌器有安全閥，溫度下降到安全閥可打開時將培養(yǎng)基取出室溫冷卻，各型號滅菌器安全開蓋溫度不盡相同。