中國藥典對于雜質(zhì)的限度檢測驗證的要求包括專屬性，檢測限和耐用性，相比較之前的鑒別測試的專屬性及耐用性，多了一個檢測限的要求。

同時，由于雜質(zhì)的限度測試中，雜質(zhì)的含量比例相對鑒別試驗是比較低的，所以在專屬性和耐用性方面的要求略有不同。

對于專屬性而言，雜質(zhì)的限度測定最靠譜的方法毫無疑問是色譜法。

在雜質(zhì)可獲得的情況下，可以向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，重點考察雜質(zhì)與主成分之間的分離度和檢出水平，同時，這種方法應(yīng)該可以保證一定的準(zhǔn)確度和精密度，尤其是準(zhǔn)確度，中國藥典盡管沒有要求，但是USP中對于雜質(zhì)限度測試的準(zhǔn)確度的要求是視具體情況而定的。

雜質(zhì)或降低產(chǎn)物不可獲得的情況下，可以通過對含有雜質(zhì)與降解產(chǎn)物的試樣，與另一個已經(jīng)驗證的方法進行對比。這里含有雜質(zhì)的試樣對于API來說，有可能來自于前道沒有經(jīng)過提純的工藝，或者是通過強光，高溫，高濕，酸堿水解或氧化的方式獲得，同時對比破壞前后的雜質(zhì)，必要時采用二級管陣列檢測器或質(zhì)譜檢測器，進行峰純度的檢查。

檢測限則是指試樣中的被測物能夠被檢測出的最低量，藥品的雜質(zhì)測定應(yīng)通過測試確定方法的檢測限。

非儀器的目視檢查法可用已知濃度的被測物質(zhì)，試驗出能可靠檢測出最低濃度或量的雜質(zhì)水平；

對于儀器法，通常采用能顯示基線噪音的分析方法，將已知濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠檢測出的最低濃度或量，一般采用3：1或2：1的信噪比時相應(yīng)的濃度做為檢測限。

接下來進行雜質(zhì)定量測定的驗證要求的相關(guān)講解。

相比較限度測定幾個關(guān)鍵的參數(shù)指標(biāo)專屬性、耐用性和檢測限而言，雜質(zhì)的定量測定又多了精密度、準(zhǔn)確度、定量限、線性、范圍的要求，可以說是各類方法驗證的類型中最為復(fù)雜的一種，這在各國或者機構(gòu)的藥典中要求基本上都是類似的，詳細可參見下面的這張附件表格（來自GMP驗證指南）。

準(zhǔn)確度是指被驗證的分析方法測量的結(jié)果與真實值或參考值之間接近的程度，一般用回收率表示。

對于雜質(zhì)的定量測定而言，可采用以下三種方法：

1）向原料藥或者制劑中加入已知量雜質(zhì)進行測定；通常試驗會設(shè)計三個不同的濃度80%、100%、120%，每個濃度制備3份供試品溶液，進行測定，計算回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；

2）如果不能得到雜質(zhì)或降低產(chǎn)物，可用被驗證的方法測定的結(jié)果與其他方法進行比對；

3）在不能測得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的響應(yīng)因子或不能測得對原料藥的相對響應(yīng)因子的情況下，可用原料藥的響應(yīng)因子，應(yīng)明確單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相對于主成份的重量比或峰面積比。

精密度是指在規(guī)定的測試條件下，同一均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的精密程度。

對于精密度的測試，有的時候容易會有一個誤區(qū)，認為對一個制備樣品重復(fù)進樣N次就可以考察分析方法的精密度，這其實只是確認了設(shè)備的精密度而已，從方法驗證的角度來看，方法精密度的驗證應(yīng)該包括整個樣品的制備過程。

精密度的方法驗證又可以進一步細分為：

重復(fù)性：相同條件，同一人不同操作的結(jié)果精密度

中間精密度：同一實驗室，不同時間，不同人，用不同設(shè)備的結(jié)果之間的精密度

重現(xiàn)性：不同實驗室，不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度。

精密度測試對于雜質(zhì)定量以及含量測定兩大類定量方法而言，差別并不太大。

精密度與準(zhǔn)確度是定量性質(zhì)的方法驗證的最重要的兩個指標(biāo)，兩者的關(guān)系可以參見下面的圖片：

定量限則與之前提到的檢測限多少有些類似，只不過雜質(zhì)定量限所采用的信噪比一般為10：1時相應(yīng)的濃度為結(jié)果來確定注入儀器的量確定定量限。

最后兩個指標(biāo)，線性與范圍其實在某種程度上有一定的類似，接下來進行關(guān)于含量的方法驗證的相關(guān)講解。

雜質(zhì)除了定量的要求之外，可能還會有限度檢查的要求，限度檢查從藥典的要求上來看，比雜質(zhì)的定量測定要求的項目要少，包括專屬性、檢測限及耐用性。

與前文提到的雜質(zhì)定量測定的要求類似，對于雜質(zhì)限度檢查的專屬性而言，需要根據(jù)雜質(zhì)是否可獲得分兩種場景進行考慮，比如最近沸沸揚揚的華海的纈沙坦事件中提到的微量雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺（NDMA），在這兩天報告中提到，NDMA暫定的每日最大攝入量參考限定值為0.1微克，相當(dāng)于EMA暫定參考限定值0.3ppm（按每日服用320mg纈沙坦計算）就屬于這種雜質(zhì)可獲得的場景。

雜質(zhì)限度檢查中的雜質(zhì)有很大的可能是工藝過程中引入，或者由于降解所產(chǎn)生，專屬性的要求是具有一定的分離度，必要時可采用二極管陣列檢測或質(zhì)譜檢測器，進行峰純度的檢查。方法驗證的文件中如果采用的是色譜法，應(yīng)附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明各個成份在色譜圖中的位置，色譜法的分離度應(yīng)符合要求。

檢測限也有兩種方法，分別是：

1）非儀器分析的目視法：用已知濃度的被檢測物、試驗出能被可靠檢測出的最低濃度或量。經(jīng)典的公式是L=CV/S，限度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積乘以濃度，再除以樣品量得到；

2）信噪比法：與定量限方法驗證的要求不同，檢測限要求的信噪比為3：1或者2：1，即已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品的信號比值應(yīng)該通過方法驗證證明。

此外，還可以根據(jù)響應(yīng)因子的標(biāo)準(zhǔn)偏差和斜率計算出檢測限，當(dāng)校正曲線包含檢測限范圍的分析物濃度時，采用校正曲線的回歸線剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或回歸線截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差可以做為響應(yīng)因子，3.3倍的響應(yīng)因子除以校正曲線的斜率，可以做為檢測限。

檢測限方法驗證應(yīng)該包括相應(yīng)的測試過程的描述，附有相應(yīng)的測試圖譜并且說明檢測限的結(jié)果，未來在制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的時候，雜質(zhì)的限度必然是大于檢測限的數(shù)值。