作者：王麗嬋 , 晁哲 , 吳燕 , 駱鵬 , 衛(wèi)辰 , 馬霄       

中國食品藥品檢定研究院, 國家衛(wèi)生健康委員會生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室, 北京 102629 

摘要：

目的：比較不同類型無細胞百日咳疫苗免疫小鼠后誘導的抗體應答及其持久性。

方法：將來自于3家企業(yè)，采用2種不同工藝生產(chǎn)的無細胞百日咳疫苗（組分苗和共純化苗）按一定比例稀釋后分別給3組小鼠皮下接種，0.5 mL/只，于第4周加強免疫，劑量與初免疫相同。于免疫后第4周、第5周、第8周、第12周、第17周、第30周、第40周、第50周和第65周取血，分離血清，檢測小鼠血清中抗百日咳抗體IgG水平（抗-PT和抗-FHA）和PT的中和抗體水平，并對其結(jié)果進行分析比較。結(jié)果：兩類疫苗組檢測結(jié)果比較，在免疫后第30周之前，兩組之間抗-PT和抗-FHA水平無顯著性差異；但在30周之后，兩組之間抗-PT和抗-FHA水平有顯著性差異（P < 0.05），組分苗組抗體水平高于共純化苗組。中和抗體方面，組分苗組中和抗體水平高于共純化苗組，兩組比較有顯著性差異（P < 0.05）。

結(jié)論：兩種類型的百日咳疫苗免疫小鼠后均能誘導產(chǎn)生體液免疫應答，組分苗組的抗體持久性（包括百日咳抗體IgG和百日咳PT中和抗體）強于共純化苗組；且百日咳IgG抗體與中和抗體之間具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：無細胞百日咳疫苗    抗體    中和抗體    免疫持久性

百日咳疫苗包括全細胞百日咳疫苗（Whole Cell Pertussis Vaccine，WPV）和無細胞百日咳疫苗（Acellular Pertussis Vaccine，APV）兩種，其中，無細胞百日咳疫苗根據(jù)百日咳工藝的不同又分為共純化無細胞百日咳疫苗和組分無細胞百日咳疫苗。共純化無細胞百日咳疫苗(以下簡稱共純苗)采用共純化技術(shù)自發(fā)酵產(chǎn)物中提取百日咳抗原，主要抗原成分為百日咳毒素（Pertussis Toxin，PT）和絲狀血凝素（Filamentous Haemagglutinin，F(xiàn)HA）。組分無細胞百日咳疫苗（以下簡稱組分苗），采用的是柱層析分別純化工藝自發(fā)酵產(chǎn)物中提取有效抗原，主要抗原包括PT、FHA和百日咳粘著素（Pertactin，PRN）三種成分，有效抗原成分明確且精確定量，質(zhì)量穩(wěn)定可控。目前，通過分別純化工藝生產(chǎn)的已經(jīng)上市的組分百日咳疫苗主要來自于進口，國內(nèi)組分百日咳疫苗尚處于新藥注冊階段。目前，國內(nèi)大部分人群使用的是我國自主生產(chǎn)的共純化無細胞百日咳疫苗。

百日咳血清學效力檢測方法（Pertussis Serological Potency Test，PSPT），即百日咳疫苗免疫小鼠后，檢測其百日咳特異性抗體IgG水平作為評價標準，此方法主要評價的是體液免疫效果。百日咳毒素CHO中和抗體法，主要檢測的是疫苗主要成分PT免疫后產(chǎn)生的功能性抗體，與PSPT法檢測的PT結(jié)合抗體不同，可以更確切地反映疫苗保護效果。意大利Von Hunolstein和美國Sutherland等人均認為此方法可輔助PSPT的檢測[1-3]。本文主要觀察這兩類百日咳疫苗免疫小鼠后，采用PSPT法和CHO中和抗體法檢測的百日咳抗體水平，并對其免疫效果進行為期65周的動態(tài)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 樣品

共純化無細胞百日咳疫苗、組分無細胞百日咳疫苗由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 實驗動物

BALb/C小鼠、雌性、6~8周、SPF級，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院動物實驗室。

1.3 主要試劑及儀器

PT、FHA標準抗原和CHO-K1細胞由中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室提供；WHO鼠源抗百日咳血清標準品97/642和WHO百日咳毒素標準品JNIH-5，簇集活性每支10000 IU，購自英國生物標準與檢定研究所（NIBSC）；抗小鼠辣根過氧化物酶標記抗體為美國Life Technologies公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基DMEM/F12（Cat. No. 21127-022）、胎牛血清（Cat. No. 10099-141）購自美國Gbico公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。酶標儀Spectra Max Plus購自美國Molecular Devices公司；EVOS成像顯微鏡購自美國AMG公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國THERMO公司。

1.4 動物實驗

將實驗小鼠隨機分為4組（Lot1到Lot3試驗組和PBS組，其中Lot1為進口組分APV，Lot2為國內(nèi)處于新藥注冊階段組分APV，Lot3為國產(chǎn)共純化APV），每組10只，腹部皮下注射經(jīng)過5倍稀釋的樣品，0.5 mL/只，于免疫第28天進行加強免疫，劑量同上。于免疫后第4周、第5周、第8周、第12周、第17周、第30周、第40周、第50周和第65周取血，采集后的小鼠血液離心后收集血清，-20℃冰箱保存待用。

1.5 百日咳特異性抗體IgG水平檢測

檢測小鼠血清中抗-PT和抗-FHA的含量，采用常規(guī)間接ELISA法進行檢測，以WHO鼠源抗百日咳血清標準品97/642作為標準（含抗PT-IgG 17 IU/支，抗FHA-IgG 143 IU/支）來計算血清中的抗體含量。PT、FHA包被抗原濃度均為3 μg·mL-1，置4 ℃冰箱過夜；洗板后按照實驗方案設(shè)計格式分別加入經(jīng)過稀釋后的待檢小鼠血清及標準品97/642，進行2倍系列倍比稀釋直至酶標板最后一排，之后按常規(guī)ELISA方法步驟檢測。終止顯色反應后，使用SoftMax pro軟件，酶標儀讀板，以WHO標準品97/642的數(shù)據(jù)為標準，應用雙平行線分析方法對待檢樣品進行統(tǒng)計分析，確定各種抗小鼠百日咳抗體的含量。

1.6 CHO細胞中和抗體滴度檢測

采用CHO細胞簇集試驗[4]。將待測樣品和WHO鼠源抗百日咳血清參考品97/642（作為陽性對照）進行2倍系列稀釋，加入稀釋至0.4 IU·mL-1的PT毒素標準品JNIH-5進行毒素中和，置37℃結(jié)合2 h；將中和完成的毒素樣品混合物加入到預先準備好的CHO細胞培養(yǎng)板中（細胞濃度3000個/孔），置5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。同時，設(shè)置只有PT毒素和CHO細胞的毒素對照、培養(yǎng)基對照和CHO細胞對照。樣品血清孔以顯示＜50%的細胞聚集的最高稀釋度為中和抗體的最后滴度。抗血清陽性對照應有中和抗體滴度；毒素對照靈敏度應小于0.03 IU·mL-1；培養(yǎng)基和細胞對照應不簇集。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件對抗體檢測數(shù)據(jù)和CHO細胞中和抗體滴度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義；Spearman相關(guān)系數(shù)分析ELISA法P T抗體結(jié)果和C H O細胞中和抗體結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 抗體水平IgG檢測

將每組百日咳抗體檢測結(jié)果取平均值，轉(zhuǎn)化為對數(shù)Log2后，進行比較分析。如圖 1所示，免疫后第4周抗-PT和抗-FHA IgG水平均已升高，Lot1、Lot2組分APV組升高水平不及Lot3共純化APV組明顯；但是加強免疫后一周檢測，即第5周檢測結(jié)果顯示，Lot1、Lot2組升高明顯，Lot3組反而沒有顯著變化，說明Lot3組初次免疫后抗體水平就已明顯升高。3組疫苗在免疫后第12周抗體水平達到峰值，之后有所下降，組分APV組從第40周開始、共純化APV組從第30周開始抗體水平有顯著性下降（P＜0.05）。Lot1組和Lot2組的抗體水平比較，二者之間沒有顯著性差異；Lot1、Lot2組與Lot3組抗體水平比較，從第30周開始，無論是抗-PT，還是抗-FHA IgG水平，Lot3組均顯著低于Lot1、Lot2組，均有顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，國產(chǎn)共純化APV疫苗免疫后抗體水平升高早，但是下降快，免疫持久性相對于組分APV疫苗組差。

  圖 1 小鼠免疫后第4周到第65周百日咳抗體檢測結(jié)果

2.2 中和抗體檢測

將3個試驗組2 7次試驗的C H O中和抗體和ELISA PT抗體的檢測結(jié)果取平均值，轉(zhuǎn)化為對數(shù)Log2后作圖，見圖 2。結(jié)果顯示，雖然在免疫后第5周到第12周，3個試驗組的抗-PT IgG水平?jīng)]有顯著性差別，見圖 1；但是，Lot3組的CHO中和抗體水平在免疫后第4周，即加強免疫前并不比Lot1、Lot2組差，而加強免疫后，卻顯著低于Lot1和Lot2組（P＜0.05）。隨著免疫后時間的延長，Lot3組的中和抗體水平下降趨勢更加明顯。

圖 2 小鼠免疫后第4周到第65周百日咳毒素CHO中和抗體檢測結(jié)果

2.3 相關(guān)性分析

分別將各試驗組的ELISA法PT抗體結(jié)果和CHO細胞中和抗體結(jié)果取對數(shù)后進行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果分別為Lot1組相關(guān)系數(shù)r=0.131，Lot2組相關(guān)系數(shù)r=0.200，Lot3組相關(guān)系數(shù)r=0.603，前兩組為低度相關(guān)，Lot3組為顯著相關(guān)。總體來說，ELISA法檢測的抗-PT IgG水平與CHO中和試驗檢測的PT中和抗體水平之間具有一定的相關(guān)性。

3 討論

無細胞百日咳疫苗有效性評價主要有兩種方法，即小鼠血清學效力方法和改良腦腔攻擊法（Modified Intracerebral Challenge Assay，MICA）。我國一直采用MICA法用于百日咳疫苗效力試驗的放行。小鼠血清學效力法主要是應用ELISA法檢測疫苗中各百日咳抗原組分在免疫小鼠后的抗體免疫反應，該方法在歐美國家已廣泛用于評價疫苗的有效性[5-6]。CHO細胞中和抗體法，主要檢測的是百日咳主要抗原PT誘導產(chǎn)生的中和抗體，而通過ELISA技術(shù)檢測到的抗體為結(jié)合抗體，中和抗體肯定具有結(jié)合抗體的性質(zhì)，但結(jié)合抗體不一定具有中和活性。

本實驗中，采用ELISA法和CHO中和抗體法檢測疫苗免疫后誘導產(chǎn)生的抗體應答，并連續(xù)監(jiān)測至免疫后第65周，評價組分APV和共純化APV在小鼠體內(nèi)的抗體應答和免疫持久性。結(jié)果顯示，ELISA法檢測的結(jié)合抗體，組分APV與共純化APV相比，在免疫后早期，到第30周，二者之間的抗體水平差異不顯著，隨后，雖然百日咳抗體水平都有下降趨勢，但共純化APV組下降更加明顯，顯著低于組分APV組。CHO細胞法檢測的PT中和抗體，在免疫后第4周，此時尚未加強免疫，共純化APV組的中和抗體水平與組分APV組的Lot1組沒有顯著差異，且高于Lot2組；但在加強免疫后，組分APV組的中和抗體水平遠遠高于共純化APV組（P ＜0.05）。統(tǒng)計學Spearman相關(guān)性分析顯示，兩種方法的檢測結(jié)果具有一定的相關(guān)性，Lot1、Lot2組為低度相關(guān)，Lot3組為顯著相關(guān)。雖然此次試驗選取的樣本數(shù)量有限，但總體來說，ELISA法檢測的抗-PT IgG水平與CHO中和試驗檢測的PT中和抗體水平之間具有一定的相關(guān)性，表明兩種檢測方法結(jié)合使用可更加全面反映抗原的免疫原性[7]。此外，PT中和抗體檢測方法及其質(zhì)量控制研究一直是本實驗室正在研究項目的重點之一，最終目標是以這種相對簡單、快捷、符合動物使用3R原則的質(zhì)量評價方法，替代目前我國使用的MICA法。MICA法試驗周期長，使用動物數(shù)量大，影響因素多。中和抗體的檢測在后續(xù)研究中將進一步細化以積累更多數(shù)據(jù)。

綜上所述，無論哪種工藝生產(chǎn)的無細胞百日咳疫苗，免疫小鼠后均能誘導產(chǎn)生抗體反應。在誘導抗體產(chǎn)生能力上，兩種類型的百日咳疫苗在免疫后前期，ELISA法檢測的抗體水平?jīng)]有顯著性差異，但隨著監(jiān)測時間的延長，共純化苗組的抗體水平下降趨勢較組分苗組顯著。中和抗體檢測結(jié)果顯示，共純化苗組顯著低于組分苗組。

參考文獻

[1] Von HunolsteinC, Gomez Miguel MJ, Pezzella C, et al. Evaluation of Two Serological Methods for Potency Testing of Whole Cell Pertussis Vaccines[J]. Pharmeuropa Bio, 2008(1): 7-18.  

[2] Sutherland JN, MaynardA JA. Characterization of a Key Neutralizing Epitope on Pertussis Toxin Recognized by Monoclonal Antibody 1B7[J]. Biochemistry, 2009, 48(50): 11982-1193. DOI:10.1021/bi901532z  

[3] Sutherland JN, Chang C, Yoder SM, et al. Antibodies Recognizing Protective Pertussis Toxin Epitopes Are Preferentially Elicited by Natural Infection Versus Acellular Immunization[J]. Clin Vaccine Immunol, 2011, 18(6): 954-962. DOI:10.1128/CVI.00561-10  

[4] Hewlett EL, Sauer KT, Myers GA, et al. Induction of a Novel Morphological Response in Chinese Hamster Ovary Cells by Pertussis Toxin[J]. Infect Immun, 1983, 40(3): 1198-1203.  

[5] Gaines DR, Horiuchi Y, Zhang SM, et al. Modified Intracerebral Challenge Assay for Acellular Pertussis Vaccines:Comparisons Among Whole Cell and Acellular Vaccines[J]. Vaccine, 2009, 27(49): 6824-6832. DOI:10.1016/j.vaccine.2009.09.014  

[6] Van Der Ark A, Von Straaten-van, De Kappelle I, Hendriksen CF, et al. Pertussis Serological Potency Test as an Alternative to the Intracerebral Mouse Protection Test:Development, Evaluation and Validation[J]. ALTEX, 1998, 15(5): 33-36.  

[7] Dalby T, Sorensen C, Petersen JW, et al. Pertussis Serology:Assessment of IgG Anti-PT ELISA for Replacement of the CHO Cell Assay[J]. APMIS, 2010, 118(12): 968-972. DOI:10.1111/j.1600-0463.2010.02664.x