蛋白質(zhì)濃度測定方法——UV法

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

（1）簡易經(jīng)驗公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

（2）精確計算

通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算最終結(jié)果：

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d為測定OD值比色杯的厚度

D為溶液的稀釋倍數(shù)

蛋白質(zhì)濃度測定方法——BCA法

原理

BCA（bicinchonininc acid）與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑混合一起即成為蘋果綠，即 BCA 工作試劑。在堿性條件下，BCA 與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將 Cu2+ 還原為 Cu+，工作試劑由原來的蘋果綠色變?yōu)樽仙珡?fù)合物。562 nm 下其光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。BioVision的BCA蛋白檢測試劑盒提供了一種簡單快速并且耐去污劑（大于5%）的手段檢測溶液中蛋白質(zhì)濃度.

成分

保存條件

運(yùn)輸溫度：室溫（標(biāo)準(zhǔn)蛋白 4～8 ℃ 運(yùn)輸）

保存溫度：室溫（標(biāo)準(zhǔn)蛋白 -20 ℃ 保存）

有效日期：12 個月

使用方法

1. 配制 BCA 工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。

2. 將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中。加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到 10 μL。取 10 μL 待測樣品加入 96 孔板的待測樣品孔中。每個測定要做 2～3 個平行。

3. 向待測樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即樣品與工作液的體積比為 1:20），混勻。

4. 37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

5. 酶標(biāo)儀 562 nm 波長下測定吸光度。

6. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。

方法二：試管法

1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應(yīng)。每個測定要做 2～3 個平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規(guī)格不同，體系需要放大到實驗將采用的比色杯準(zhǔn)確讀數(shù)所需要的體積。

2. BSA 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制，使待測定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個反應(yīng)準(zhǔn)備 3 個平行測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般 5~6 個點即可。根據(jù)樣品的估測濃度確定各點的具體濃度。稀釋 BSA 時可以用水或與樣品一致的溶液。如待測樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及 BCA 工作液。

3. 取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

4. 將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在 562 nm 波長下測定吸光度。

蛋白質(zhì)濃度測定方法——考馬斯亮藍(lán)法

實驗原理

考馬斯亮藍(lán) (Coomassie Brilliant Blue) 法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法之一。

考馬斯亮藍(lán) G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變?yōu)?595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
 

突出優(yōu)點

（1）靈敏度高，據(jù)估計比 Lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá) 1 mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。

（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費(fèi)時和需要嚴(yán)格地控制時間。

（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測定法。

缺點

（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用 g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。

試劑與器材

1、試劑

考馬斯亮藍(lán)試劑：

考馬斯亮藍(lán) G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。

2、標(biāo)準(zhǔn)和待測蛋白質(zhì)溶液

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。

（2）待測蛋白質(zhì)溶液。

人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。

3、器材

試管 1.5×15 cm（×6），試管架，移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計。

操作方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取 7 支試管，按下表平行操作。

搖勻，1 h 內(nèi)以 0 號管為空白對照，在 595 nm 處比色。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 A595 nm 為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定

測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的 A595 nm 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

注意事項

（1）在試劑加入后的 5-20 min 內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。

（2）測定中，蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。

（3）利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復(fù)測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。