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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2018-12-04 17:22
蛋白定量最常用的兩種方法BCA法、Bradford（考馬斯亮藍(lán)）法。
現(xiàn)將其原理與實(shí)驗(yàn)選擇中略微差別簡(jiǎn)介如下
原理
BCA法原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，吸光強(qiáng)度與蛋白濃度成正比。測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。
Bradford法原理：考馬斯亮藍(lán)在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。在一定的濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長(zhǎng)為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)結(jié)合，在2-5min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。
選擇區(qū)別
BCA法：該方法可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。但該方法受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。
Bradford法：該方法樣品中β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)的濃度可高達(dá)1M，二硫蘇糖醇(DTT)的濃度可高達(dá)5mM。但該方法受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。
來源：AnyTesting
