1. 色譜柱柱壓 

2. 色譜峰峰形 

3 . 色譜峰保留值 

4 . 色譜柱柱壽命

1、柱壓高多少正常？

同一條件：新色譜柱，C18，5µm，球形，4.6×250mm，100%甲醇，1mL/min，25℃，管路內徑0.3mm（0.010″），通常:＜7MPa。

如果柱壓高了，先確認出壓力升高的組件，有可能是色譜柱也可能是其他組件的原因。色譜柱污染、填料堵塞、篩板堵塞都會造成壓力升高。

2、確定壓力升高來源？

保護柱-卸下保護柱，儀器堵塞-卸下色譜柱，色譜柱進口端堵塞-反方向測試（不是反沖！！）如果是色譜柱引起的柱壓升高，問題是……

3、沖洗色譜柱

反相色譜柱（C18,C8）

按照以下方式沖洗：

a、 水/乙腈95/5→0/100 

b、

如果不行，可在異丙醇里加1%TFA。

使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱，在重新使用反相流動相以前，必須用異丙醇過渡！正相色譜柱（SiO2.Diol），以下溶劑至少各50ml沖洗色譜柱:

原則：使用比MP更強的溶劑沖洗二氯甲烷>丙醇>四氫呋喃>乙醇>乙腈>甲醇>水。那么沖洗色譜柱  一定正確嗎？

C18柱上蛋白的沖洗：  是DMSO而不是THF！！

C18柱上淀粉的沖洗：  是水而不是甲醇！！

根據強保留污染物性質，選擇合適的沖洗溶劑和程序！！

4、沖洗篩板

強溶劑、反方向、低流速。

反相色譜柱：水/乙腈95/5→0/100

正相色譜柱：

50%甲醇＋50%三氯甲烷→ 100%乙酸乙酯

－沖洗篩板不要連接檢測器

－不建議用戶自行更換篩板

5、預防柱壓過高

a、使用保護柱

b、樣品前處理（重點討論樣品類型）

c、經常沖洗色譜柱

d、過濾流動相

e、緩沖液或水不要保存過長時間

6、樣品基質如何去除 ？

制劑：淀粉、硅膠、其他添加劑

中藥：強疏水性成分

常見以下幾種情況：色譜峰拖尾、色譜峰分裂、色譜峰擴展，許多色譜峰峰形問題都是復合型問題， 造成色譜峰擴展和柱效降低；色譜峰擴展和拖尾或拖尾隨保留加劇。從以下幾個方面色譜柱問題、溶劑效應、進樣量（過載）、樣品的特性、柱外效應來分析。

1、色譜柱問題

污物在柱進口處積聚－強溶劑沖洗柱子

二次保留效應－加入掃尾劑,10mM的TEA

重金屬污染－使用高純硅膠基質色譜柱

對于難溶解的物質：小體積強溶劑溶解以后用MP稀釋，掃尾劑：30mM的TEA（B性化合物），醋酸胺（A性化合物）

二次效應

不加TEA                  10mM的TEA

ASB C18,4.6×150mm，5µm，85% 25mM NaH2Na，15%ACN 1mL/min, 35℃

硅膠純度

初始的硅膠基質，酸洗后的硅膠基質，流動相：20mM三甲胺

金屬污染C18硅膠造成的堿性藥物的拖尾

2、柱外效應

色譜柱：150×0.45mm, 硅膠柱

流動相：Hexane-CAN(99:1,V/V)

流    速：2.0mL/min

(a) 10µL進樣閥與8µL檢測器流，通池的商品色譜儀

(b) 0.5µL進樣閥與1µL檢測器流通池的商品色譜儀

柱外效應造成的色譜峰拖尾

3、溶劑效應

樣品體積：30µL

流  動  相：18% 乙腈-H2O

分別以純乙腈和流動相為溶劑注 入咖啡因（A峰）與水揚酸胺（B峰）樣品

解決方法：

1、使用流動相溶解樣品

2、加大濃度，降低進樣量

樣品溶劑進樣的影響

4、樣品特性

葡萄糖端基異構體的轉化— 兩個峰

提高溫度，或提高pH值，轉化加快 一個峰

色譜柱：Venusil HILIC 5µm 4.6×250mm；流動相：乙腈－水 (80: 20)；柱溫：30℃ ；檢測器：蒸發光散射檢測器；樣品：葡萄糖對照品水溶液，流速：1mL/min

5、柱外效應對峰形/分離度的影響

死體積是指從進樣器到檢測器的體積，這一段沒有被色譜填料所填充的部分，死體積大，會導致峰展寬，峰形變差等等。

6、柱外效應對峰形/分離度的影響

盡量減小連接管路體積。尤其使用窄徑柱時！

柱后和檢測器之間標配一個兩道，去掉后測試明顯改善

7、柱外效應主要影響N值

進樣量大主要引起柱子超載，保留時間和N值下降，一般憑經驗找到是保留時間和N最大的進樣量。一般：0.46mm的色譜柱最大進樣量為10-50ug。一般開始時大樣品量進樣（10-50ug），然后逐漸降低進樣量直至保留時間穩定。

8、色譜峰拖尾/擴展/分裂

色譜柱污染：復雜樣品基體或待測樣品量大

顆粒物堵塞篩板：復雜樣品基體或待測樣品量大

色譜柱死體積：流動相pH>7時，硅膠溶解(除非使用特殊色譜柱)，死體積增加。 

樣品溶劑效應： 樣品溶劑強于流動相-裂分峰和擴展峰取決于樣品量

1、保留時間變化

漂移（單方向增加或減小 ）波動（無規律的變化）

2、保留時間變化原因

色譜柱平衡、固定相變化、色譜柱污染、流動相組成發生變化、疏水坍塌

3、色譜柱平衡

流動相變化（梯度洗脫的平衡）、溫度變化、流速變化、更換色譜柱

至少使用10-20倍柱體積流動相平衡色譜柱

4、固定相變化

鍵合相流失：通常保留時間變短，使用耐酸色譜柱：venusil ASB C18和C8系列

硅膠溶解：裂峰，使用耐堿的色譜柱：Durashell C18 ，RP

5、色譜柱污染

清洗：合適的清洗方式

使用保護柱：請特別注意何時更換保護柱、壓力、分離效果、時間、進樣次數幾個方面。

6、流動相組成發生變化

易揮發性組分揮發：夏天，注意密閉容器，不建議循環使用流動相一相小于10%的在線混合正確配置流動相（V:V）

7、疏水坍塌

C18色譜柱，若沒有指明，不得使用100%水作為流動相 （至少含有5%的有機相）使用親水色譜柱（若水相必須大于95%）：Venusil MP C18、Venusil HLP、Venusil ASB C18，C8

8、建立良好重現性方法

選用質量好的色譜柱、 選用良好的流動相體系、用流動相充分平衡柱子（如MP中含THF，三乙基胺或四丁基銨等胺類調節劑或離子對試劑，特別是烷基上有十個以上的碳原子的情況！）、 采用合適的試驗技術，確保日間穩定、 預存色譜柱

1、色譜柱的壽命應有多長

a、操作者對色譜柱的使用和處理

b、注入樣品的類型

c、干凈樣品：進樣至少2000次。

保證良好柱壽命與性能的方法 

總體來說色譜柱常見問題癥狀是柱壓過高、峰形不好、保留時間不穩。一般來說色譜柱常見問題原因如下：

色譜柱篩板問題－篩板或柱床部分堵塞；

強保留的樣品組分－吸附樣品雜質（污物）；

色譜柱填充不好；

柱壓問題－機械或熱沖擊造成空洞

化學影響－基質或鍵合相被化學侵蝕

有時此類問題并非由色譜柱引起，而是儀器和實驗條件！