食藥總局發布結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑注冊技術審查指導原則（2018年第57號）

 

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結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑注冊技術審查指導原則

 

本指導原則旨在指導注冊申請人對結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，如不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應（即γ-干擾素釋放試驗，IGRAs）的主要原理：受到結核分枝桿菌抗原刺激致敏的T淋巴細胞（T細胞）再次遇到相同抗原時可產生γ-干擾素，IGRAs通過檢測全血或者分離自全血的外周血單個核細胞（PBMC）在結核分枝桿菌特異性抗原刺激下產生的γ-干擾素，判斷受試者是否存在結核分枝桿菌感染。目前，國際上較成熟的IGRAs有兩種：一是采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）方法檢測全血中致敏T細胞再次受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的γ-干擾素水平；二是采用酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）方法測定在結核分枝桿菌特異性抗原刺激下，外周血單個核細胞中能夠釋放γ-干擾素的效應T細胞數量。

上述兩種檢測方法的原理類似，檢測技術和操作程序略有不同，采用的結核分枝桿菌特異性抗原主要存在于結核分枝桿菌復合群中，在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中缺失。

目前，結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑是指：利用免疫學檢測技術，如ELISA或ELISPOT技術等，以結核分枝桿菌特異抗原刺激T細胞產生的γ-干擾素為檢測靶標，對人靜脈全血中的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應進行體外檢測的試劑，可用于結核分枝桿菌感染的檢測或用于結核病的輔助診斷。本指導原則所述內容是針對結核病輔助診斷預期用途的，對于預期用途為結核分枝桿菌感染檢測的申報試劑，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證。

本指導原則的技術要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，對于其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據產品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及國內外同類產品上市情況介紹等內容。其中，同類產品上市情況介紹部分應著重從預期用途、方法學、檢驗原理、結核分枝桿菌特異性刺激抗原以及最低檢測限等方面寫明申報試劑與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。如所用刺激抗原為新發現的結核分枝桿菌特異性抗原，則應詳細論述其能提高該類試劑靈敏度和特異性的科學依據，并提供充分的支持資料。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號，以下簡稱44號公告）的相關要求。

（二）主要原材料的研究資料

應提供主要原材料如抗原肽/重組抗原、抗體、陰性對照、陽性對照、標準品（γ-干擾素）、酶以及企業參考品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質量控制標準等的研究資料。如主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定；如主要原材料購自其他供應商，應提供的資料包括：供應商提供的質量標準、出廠檢定報告或性能指標證書，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。

企業參考品：申請人應提供企業參考品的詳細的來源、制備和確定等資料。

對于采用ELISPOT方法的申報試劑，企業參考品至少應包括：陰性參考品、陽性參考品和精密度參考品。其中，陽性參考品建議采用結核病患者（菌陰和菌陽）的全血，陰性參考品建議采用健康人和其他易混淆疾病患者的全血，精密度參考品建議采用結核病患者的全血。如申請人采用除全血之外的其他樣本形式作為企業參考品，請提交申請人所采用的企業參考品的組成、來源、穩定性、延續性、性能可控性等詳細的理論和試驗數據。

對于采用ELISA方法的申報試劑，企業參考品至少應包括：陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、線性參考品、準確度參考品和精密度參考品等。其中，陰性參考品、陽性參考品和精密度參考品的設置可參考ELISPOT方法申報試劑的相關要求。最低檢測限參考品、準確度參考品和線性參考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有γ-干擾素的溶液（建議采用血漿作為基質溶液）。

對于陰性/陽性對照：申報試劑的質控體系通過設置陽性、陰性對照來實現，申報資料應詳細描述各種對照的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。本指導原則的技術要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，對于采用上述方法學的結核細胞類檢測試劑，建議至少設置陽性對照和陰性對照。陽性對照一般采用外周血單個核細胞非特異性刺激物，用于質控外周血單個核細胞功能是否正常，避免產生假陰性。陰性對照用于控制細胞在活化過程中所產生的各種因子的非特異性影響，避免產生假陽性。

標準品（如適用）的選擇及質量標準：應詳細描述標準品原料的來源、制備、純度、濃度（或復溶后濃度）、分子量、功能活性等的確定和驗證資料。

多肽/重組抗原的選擇及質量標準：應詳細描述多肽的來源（來自何種抗原）/重組抗原的來源、組成、分子量、純度、濃度、重組抗原的內毒素含量、刺激活性、特異性等的確定和驗證資料。如為凍干抗原，還應設置水分含量的質控標準。

抗體的選擇及質量標準：應詳細描述抗體的來源、純度、濃度、分子量、刺激免疫原、效價和功能活性等的確定和驗證資料。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

主要生產工藝包括：配制工作液、分裝和包裝等，可用流程圖表示。應提供主要生產工藝的確定依據，包括試驗方法和數據等。

反應體系研究資料應能對產品說明書中檢驗方法部分涉及的基本內容，如樣本用量、試劑用量、反應條件等，提供確定的依據，包括試驗方法和數據等。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交對申報試劑進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體的試驗方法、內控標準、實驗數據和統計分析等。對于結核分枝桿菌細胞免疫反應檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.對于采用ELISA方法的申報試劑

檢驗方法分為兩大部分：（1）將結核分枝桿菌特異性抗原與全血樣本共培養，獲得含有γ-干擾素的血漿樣本；（2）以γ-干擾素標準品做標準曲線，對第（1）步的血漿樣本采用ELISA方法進行定量檢測。基于該方法學的分析性能，需要對上述兩方面的性能均進行驗證。

1.1最低檢測限

申請人可采用合理方法確定和驗證申報試劑的最低檢測限。建議采用含有系列γ-干擾素稀釋濃度的樣本，對每個濃度樣本進行多次重復檢測，選取測定平均OD值-2SD大于0濃度測定平均OD值+2SD的濃度作為最低檢測限濃度。

1.2線性范圍

線性范圍確定的研究應使用高值樣本（采用血漿基質，采用可溯源至國際校準品的方法對血漿樣本中的γ-干擾素進行定量）進行梯度稀釋，稀釋液應使用血漿，應包含接近最低檢測限的臨界值濃度。通過評價一定范圍內的線性關系確定申報試劑的線性范圍。

1.3準確度

可采用如下方法進行評價，如：與國際標準品的偏差分析、回收試驗或者方法學比對等方法，申請人可根據實際情況選擇合理方法進行研究。

1.4分析特異性

1.4.1交叉反應

交叉反應的驗證主要考慮全血自身含有的細胞因子或全血刺激培養過程中產生的細胞因子與申報試劑所用γ-干擾素抗體對是否存在交叉反應。需要進行交叉反應驗證的細胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建議在0濃度γ-干擾素水平和中濃度γ-干擾素水平分別進行交叉反應的驗證。

同時，建議申請人采用一定數量的其他常見分枝桿菌感染患者的全血樣本進行試驗，評價申報試劑的特異性。

1.4.2干擾物質

應對全血樣本中常見的干擾物質進行驗證，包括：抗凝劑、甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素、類風濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體和免疫抑制劑等。建議采用含有不同濃度γ-干擾素的血漿樣本分別進行干擾物質的驗證，給出不會對γ-干擾素檢測值產生干擾的最高干擾物濃度。

1.5精密度

1.5.1采用全血樣本進行試驗的精密度：分別采用陽性全血樣本和陰性全血樣本，進行不少于10次重復檢測，判斷檢測結果的陰陽性，多次重復檢測結果應一致。

1.5.2采用含有γ-干擾素的血漿樣本進行試驗的精密度：建議在γ-干擾素低濃度和中等濃度2個濃度水平分別進行驗證。

1.5.2.1低濃度樣本：γ-干擾素濃度略高于試劑盒的最低檢測限（n≥20）。

1.5.2.2中等濃度樣本：采用中等濃度的樣本進行重復檢測，CV≤15%（n≥20）。

1.5.3申請人應設置合理的精密度評價周期，以便對批內/批間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

1.6陰性參考品符合率

建議選擇至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血樣本進行試驗，上述健康人和患者應包括不同等級的結核菌素（PPD）皮試人群。

1.7陽性參考品符合率

建議選擇至少20份結核病患者（至少10例菌陽，至少10例菌陰）全血樣本進行試驗。

1.8標準品的溯源資料

γ-干擾素具有國際標準品，建議檢測結果的量值溯源至國際標準品。申請人應提供從國際標準品到產品標準品的溯源鏈以及各級賦值資料。

2.對于采用ELISPOT方法的申報試劑

檢驗方法為：將結核分枝桿菌特異性抗原與分離的外周血單個核細胞（PBMC）共培養，活化刺激PBMC分泌的γ-干擾素被微孔板上包被的單克隆抗體捕獲，再用酶標記的另一個單克隆抗體進行反應顯色，一個斑點即代表一個細胞，計數斑點的多少，從而判斷是否存在結核分枝桿菌特異性的細胞免疫反應。基于該方法學的分析性能，需從下述幾個方面進行性能驗證。

2.1分析特異性

2.1.1交叉反應

交叉反應的驗證主要考慮PBMC刺激培養過程中產生的細胞因子與申報試劑所用γ-干擾素抗體對是否存在交叉反應。需要進行交叉反應驗證的細胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建議在0濃度γ-干擾素水平和中濃度γ-干擾素水平分別進行交叉反應的驗證。

同時，建議申請人采用一定數量的其他常見分枝桿菌感染患者的全血樣本進行試驗，評價申報試劑的特異性。

2.1.2干擾物質

應對全血樣本中常見的干擾物質進行驗證，包括：抗凝劑、甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素、類風濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體和免疫抑制劑等。建議采用全血樣本進行干擾物質的驗證，給出不產生干擾的最高干擾物濃度。

2.2精密度

采用全血樣本（包括高斑點數樣本、中等斑點數和低斑點數樣本）分別進行精密度評價，進行不少于10次重復試驗，判斷檢測結果的陰陽性，多次重復檢測結果應一致。同時，還應計數檢測孔斑點數，計算其CV值，CV值應≤25%。

申請人應設置合理的精密度評價周期，以便對批內/批間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

2.3陰性參考品符合率

建議選擇至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血樣本進行試驗，上述健康人和患者應包括不同等級的結核菌素（PPD）皮試人群。

2.4陽性參考品符合率

建議選擇至少20份結核病患者（至少10例菌陽，至少10例菌陰）全血樣本進行試驗。

（五）陽性判斷值的研究資料

此類試劑的陽性判斷值較為復雜，陽性判斷值對應產品說明書中“檢驗結果的解釋”部分的內容，申請人應對產品說明書中“檢驗結果的解釋”部分所涉及的各個數值提供詳細的確定和驗證資料。該部分資料應采用臨床樣本進行試驗，請注意臨床樣本的選擇應與申報產品聲稱的預期用途相一致。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行確定。

（六）穩定性研究資料

穩定性包括申報試劑穩定性和樣本穩定性（包括全血樣本穩定性和血漿樣本穩定性）。前者主要包括實時穩定性（有效期）、開封穩定性及凍融次數限制（如適用）等。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內容應符合《辦法》、44號公告和《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的規定，以下僅結合結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑的具體特點對其臨床試驗中應重點關注的內容進行闡述。

1.臨床試驗機構的選擇

申請人應當選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構，按照法規要求開展臨床試驗。

2.對比試劑的選擇

對于預期用于結核病輔助診斷的申報試劑，申請人可選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱申報試劑）與對比試劑進行比較研究試驗，證明本品與已上市產品等效。

3.臨床試驗對象的選擇

對于預期用于結核病輔助診斷的申報產品，臨床試驗對象應滿足：（1）臨床試驗總病例至少1000例；（2）具有結核病相關體征/癥狀的疑似結核病患者；（3）最終臨床診斷為結核病患者的病例中，應包括肺結核患者和肺外結核患者，并且涂片陰性的肺結核患者占所有肺結核患者的比例不應小于50%；單純肺外結核患者至少30例；（4）非結核的其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病的患者病例（最終臨床診斷不是結核病），包括肺炎、肺癌、支氣管炎、支氣管擴張、非結核分枝桿菌病、慢阻肺等，其中肺癌至少50例；（5）上述人群應包括PPD陰性和陽性人群，不能人為選擇PPD陰性人群進行臨床試驗；（6）各臨床試驗機構的樣本量和樣本分布應相對均衡。

全血樣本不能凍融，臨床試驗應采用新鮮樣本，樣本采集和保存等應滿足申報試劑和對比試劑說明書的相關要求。

4.臨床試驗方法、臨床原始數據及統計分析

4.1分別依據申報試劑和對比試劑各自的說明書對入組臨床樣本進行檢測，記錄結果。

4.2臨床報告中應明確：總樣本例數；臨床診斷為肺結核患者的總例數，說明涂片陰性和涂片陽性的肺結核患者例數；肺外結核患者的例數，說明各類肺外結核患者的例數；非結核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病樣本例數，并詳細說明各類非結核疾病的患者例數。

4.3臨床原始數據應以列表的方式表示，包括每個病例樣本的年齡、性別、臨床診斷結果、申報試劑的結果以及對比試劑的結果等。

4.4對臨床試驗數據的統計應選擇合適的統計方法，如受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。常選擇四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統計學差異。

4.5申報試劑對涂片陰性的肺結核患者和肺外結核患者均應有一定的檢出率。

5.結果差異樣本的驗證

對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應采用臨床上公認較好的第三方試劑或其他合理方法進行復核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。

6.臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應保持一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申請人的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的樣本入選/排除標準，任何已經入選的樣本再被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。各臨床試驗機構選用的對比試劑應保持一致，以便進行合理的統計學分析。

7.其他問題

如果申報試劑的預期用途為結核分枝桿菌感染的檢測，申請人應按照法規要求，設置合理的對比方法，選擇合適的預期適用人群，進行臨床試驗。

（八）產品技術要求

產品技術要求應符合《辦法》和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的相關規定。內容主要包含產品性能指標和檢驗方法，并在附錄中明確主要原材料、生產工藝及半成品檢定要求。

對于采用ELISA方法的申報試劑，產品技術要求的性能指標至少應包括：外觀、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率、線性、準確度、最低檢測限和精密度等。對于采用ELISPOT方法的申報試劑，產品技術要求的性能指標至少應包括：外觀、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率和精密度。

（九）產品注冊檢驗報告

根據《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產品應在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行連續三個生產批次樣品的注冊檢測。

（十）產品說明書

產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致。結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑說明書的重點內容進行說明。

1.【預期用途】

應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產品用于體外定性檢測人新鮮外周靜脈抗凝血中結核分枝桿菌特異性的T細胞免疫反應，用于結核分枝桿菌感染的檢測或者用于結核病的輔助診斷（根據臨床試驗等研究資料確認預期用途）。

1.2說明與預期用途相關的臨床適應癥背景情況，說明相關的臨床或實驗室診斷方法。

1.3待測人群特征介紹：具有結核病相關體征/癥狀的疑似結核病患者、地域要求或年齡限制（如有）等。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

2.3申報試劑的注冊單元不應包含真空采血管，真空采血管應按相應法規申報注冊。

3.【檢驗原理】

3.1說明試劑盒所用的刺激抗原/抗原肽（名稱、是否多肽抗原/重組抗原），以及所用抗原/抗原肽在卡介苗和非結核分枝桿菌中的存在情況。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性、開封穩定性、復融穩定性、凍融次數要求（如適用）等，應明確具體的儲存條件及有效期。

5.【樣本要求】

重點明確以下內容：

5.1樣本的采集：明確所用抗凝劑。

5.2樣本的保存：

5.2.1對于采用ELISPOT方法的申報試劑，應明確：全血樣本進行外周血單個核細胞分離前的保存溫度與時間；分離后外周血單個核細胞在與抗原孵育培養前的保存溫度與時間。

5.2.2對于采用ELISA方法的申報試劑，應明確：全血樣本在與抗原孵育培養前的保存溫度與時間。

6.【檢驗方法】

該類產品的檢測步驟繁多，應詳細描述從全血采集開始到結果判讀前的每個步驟，并明確注意事項。重點關注以下問題：對于采用ELISPOT方法的申報試劑，明確培養時所用外周血單個核細胞的數量以及所用培養基類型。

7.【檢驗結果的解釋】

結合陽性對照、陰性對照以及樣本管檢測結果，以列表的形式對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述，明確灰區結果的處理方式。

8.【檢驗方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

8.2有關假陰性結果的可能性分析，如：某些免疫功能受損的患者，可能導致假陰性。

8.3有關假陽性結果的可能性分析，如：與其他分枝桿菌是否存在交叉反應。

9.【產品性能指標】

9.1最低檢測限（如適用）：說明試劑的最低檢出濃度，簡單介紹最低檢測限的試驗方法及結果。

9.2企業陰陽性參考品的檢測符合情況：簡單介紹陰陽性參考品的組成和符合率結果等信息。

9.3精密度：明確精密度參考品的組成及結果。

9.4分析特異性

9.4.1交叉反應：明確可能產生交叉反應的其他細胞因子的驗證情況。

9.4.2干擾物質：明確樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

9.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

9.6境外（如適用）和境內臨床試驗數據總結。