一、接種

1、接種定義

接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。

2、接種工具

在實驗室中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。

3、微生物檢驗常見接種方法

（1）劃線接種法

平板劃線分離法--分區劃線分離法

①用接種環先將培養物涂布于平板1區并作數次劃線，再在2、3……區依次劃線；

②每劃完一個區域，轉動培養皿約70度角，并將接種環滅菌一次，待冷后再劃下一區域；

③每一區域的劃線均接觸上一區域的接種線1～2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落；

④其他操作與上述曲線劃線分離法相同。

（2）斜面接種法

主要用于經劃線分離培養所獲得的單個菌落的移種，以及觀察細菌的某些培養特征。

以菌種移種為例，其接種方法是：

①  取一菌種管和培養基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側面，使菌種管位于外側，培養基管位于內側；

②  右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞。火焰滅菌接種環；

③  以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內管），將兩管口迅速通過火焰1~2次；

④將已滅菌的接種環伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續劃線，直至斜面上方頂端；

⑤取出接種環，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內管）；最后將接種環經火焰滅菌放好；

⑥做好標識，置35℃培養箱中培養18~24小時。斜面培養一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。

（3）涂布接種法

涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計算活菌數，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用于檢測化學因素對微生物的抑殺效應。

原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使長出單菌落而達到分離的目的。

（4）液體接種法（肉湯接種）

①如斜面接種法持好菌種管及培養基管；

②滅菌接種環，從菌種管取菌，伸入培養基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養基液體調和，使細菌混合于培養基的液體中。液體培養基一般以18~24小時培養后觀察生長特征。

肉湯培養可觀察如下幾項：

a.發育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛；

b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長；

c.沉淀：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；

d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）；

e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發酵培養基則主要觀察是否產酸和有無氣體。

（5）穿刺接種法（半固體接種）

多用于保存菌種、觀察動力及厭氧培養等也可以用于觀察細菌的某些生化反應。

①如斜面接種法持好菌種管及培養基管；

②以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達近管底部（但不能完全刺到管底），接種針應沿原路退出；

③經培養后半固體培養基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養基清亮表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養基混濁表示細菌有動力。

二、分離純化

1、幾個定義

混和培養物：含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物（Mixed culture）；

純培養：如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養（Pure culture）；

分離純化：在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物，得到純培養的過程稱為分離純化。包括傾注平板法、涂布平板法、平板劃線法等等。

2、傾注平板法（倒平板）

將無菌培養皿放入生物安全柜或凈化臺中，然后分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布，待凝固之后，把這平板倒置在恒溫培養箱中培養。單一細胞經過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物。整個操作過程應嚴格按照無菌操作。

三、微生物的培養方法

微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養物濃度、溫度、水分、氧氣、pＨ等。微生物的種類不同，培養的方式和條件也不盡相同。通常分為：

1、一般培養法（需氧培養）   

培養溫度：25~37℃ 。

2、厭氧培養方法

（1） 簡易的厭氧培養法：

A、 庖肉培養法

B、鐵絲圈厭氧培養法

C、焦性沒食子酸法

（2） 厭氧罐法

（3） 厭氧手套箱法

厭氧缸法：

厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學的方法使缸內造成厭氧環境，從而將厭氧菌培養出來。

接種好標本的平板或液體培養基試管，可放入厭氧缸內培養。

厭氧罐法：

裝入待培養的對象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合氣（N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V）。

3、二氧化碳培養法

（1）燭缸法

（2）二氧化碳置換法

（3）化學法

每一升用重碳酸鈉0.4克與濃鹽酸0.35亳升加入。

（4）二氧化碳培養箱法

四、微生物常規鑒定技術

1、形態結構和培養特性觀察

（1）在固體培養基上，觀察：

菌落大小、形態、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等；

（2）在液體培養中：

表面生長情況（菌膜、環）混濁度及沉淀等；

（3）半固體培養基穿刺接種：

觀察運動、擴散情況。

2、染色鏡檢

（1）染色原理

由于微生物細胞含有大量水分，機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差， 必須進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態和結構。

微生物中細菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。

（2）染色方法

①簡單染色法

簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態。

②復染色法

用兩種或多種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。

（3）革蘭氏染色法

①原理

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫師Gram創立。

染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；

染色反應呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G―表示。

細菌對革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。

②細菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察

A）取培養物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同；

B）用草酸銨結晶紫染色1min后水洗；

C）加碘液媒染1min后水洗；

D）斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20～30s，隨即水洗；

E）用蕃紅染液復染30s，水洗；

F）用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。