平板劃線分離法:是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環在平板培養基表面，通過分區劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，經培養后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。

為方便劃線，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養基，培養基應厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有分區劃線法和連續劃線法兩種（如圖1， A、B）。

圖1

分區劃線法是將平板分四區，故又稱四分區劃線法。劃線時每次將平板轉動60~70°劃線，每換一次角度，應將接種環上的菌燒死后，再通過上次劃線處劃線；

另一種連續劃線法是從平板邊緣一點開始，連續作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當中不需灼燒接種環上的菌。

1）連續劃線法

接種環于酒精燈外焰燒至紅透，接種棒也要充分灼燒，最后再集中燒接種環至紅。

輕輕搖勻待接種試管，左手手心托待接種試管底側部，右手執接種環，右手小指拔下試管塞，于酒精燈附近將接種環伸進試管，稍候，再插入待接接種液中，蘸一下，取滿一環，抽出、燒塞、蓋蓋、放回試管架。或將接種環通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環冷卻，然后以無菌操作接種環直接取平板上待分離純化的菌落。

于靠近酒精燈處打開平皿蓋約30°，右手將環伸進平皿，將菌種點種在平板邊緣一處，輕輕涂布于瓊脂培養基邊緣（如圖2），抽出接種環，蓋上平皿蓋，然后將接種環上多余的培養液在火焰中灼燒，打開平皿蓋約30°伸入接種環，待接種環冷卻后，再與接種液處輕輕接觸，開始在平板表面輕巧滑動劃線，接種環不要嵌入培養基內劃破培養基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關上皿蓋。灼燒接種環，待冷卻后放置接種架上。培養皿倒置于適溫的恒溫箱內培養（以免培養過程皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。培養后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態，鏡檢后再接種斜面。

圖2

2）分區劃線法

取菌、接種、培養方法與“連續劃線法”相似。

分區劃線法分離時平板分四個區，故又稱四分區劃線法。其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線面積應最大。為防止第4區內劃線與1、2、3區線條相接觸，應使4區線條與1區線條相平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120°左右。

先將接種環沾取少量菌在平板1區劃3~5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋，將平板轉動60~70°，右手把接種環上多余菌體燒死，將燒紅的接種環在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區劃線的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉動約60~70°，同樣依次在3、4區劃線。劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，同上法培養，在劃線區觀察單菌落。

該法主要用于單個菌落的純培養、保存菌種或觀察細菌的某些特性。

（1）左手平托兩支試管，拇指按住試管的底部。外側一支試管是斜面上長有菌苔的菌種試管，內側一支是待接的空白斜面，兩支試管的斜面同時向上。用右手將試管塞旋松，以便在接種時容易拔出。

（2）右手拿接種環（如握毛筆一樣），在火焰上先將環端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌．

（3）將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指和掌心將兩支試管的試管塞一并夾住拔出，試管塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。注意不得將試管塞隨意丟于桌上受到沾污，試管口切勿燒得過燙以免炸裂。

（4）將已灼燒的接種環伸入外側的菌種試管內。先把接種環的先端觸及無菌苔的培養基上使其冷卻（如果操作迅速，此時接種環尚未完全冷卻）。再根據需要用接種環沾取一定量的菌苔，注意勿刮破培養基。將沾有菌苔的接種環迅速抽出試管，注意勿使接種環碰到管壁或管口上。

（5）迅速將沾有菌種的接種環伸入另一支待接斜面試管的底部，輕輕向上劃線（直線或曲線，根據需要確定），勿劃破培養基表面。

（6）接好種的斜面試管口再次過火焰，試管塞底部過火焰后立即塞入試管內。

（7）將沾有菌苔的接種環在火焰上燒紅滅菌。先在內焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，會使菌體爆濺，造成污染。

（8）放下環后，再將試管塞旋緊，在試管外面上方距試管口2～3cm處貼上標簽。

斜面接種方法及無菌操作過程如下具體操作過程見圖3。

圖3

用接種針經火焰滅菌，沾取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養基中心至底部，然后將挑起菌落的接種針平行于管壁插入瓊脂斜面底部、沿著原接種線將針拔出、燒試管塞和試管口、塞上試管塞，再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉。要做到手穩、動作輕巧快速。見下圖4。（a:垂直接種法，b：水平接種法）

1）液體接種法

包括從外面菌種接入培養液，或從液體菌種接入液體培養液，兩種情況都可以用接種環接種。但在培養量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，要求無菌操作。

左手持試管，右手將燒灼過的接種環伸入菌種管，待冷卻后，取菌液一環，立即移入培養基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，然后將試管稍傾斜，并沾取少許液體調和，使菌液混合于培養基中(圖5，A)

2）半固體培養基接種法   

將燒灼過的接種針插入菌種管冷卻后，沾取菌液少許，立即垂直插入半固體培養基的中心至接近于管底處，但不可直刺至管底，然后循原路退出(圖5，B)。管口通過火焰，塞上棉塞，接種針燒灼滅菌后放下。

將上述已接種好的培養物，37℃度恒溫箱內培養，24小時后取出觀察結果。

用無菌移液管吸取菌懸液0.1mL，滴加于培養基平板上，右手持無菌涂布棒，左手拿培養皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持涂布棒與培養皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或將培養基劃破。接種后，將平板倒置于恒溫箱中，培養觀察。（圖6）