介紹了最近色譜研究的幾個(gè)值得注意的重要進(jìn)展，包括UPLC高壓下蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化、HPLC流動(dòng)相統(tǒng)一pH標(biāo)尺的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用、超細(xì)粒徑UPLC中的滑移流研究、多維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的LC-GC×ＧCMS／MS和毛細(xì)管離子色譜-CE-MS方法、非水硅膠固定相中產(chǎn)生甲硅醚的證據(jù)以及用于實(shí)時(shí)呼氣分析的新方法。

　　高壓下的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化與UPLC中壓力的影響

　　蛋白質(zhì)因?yàn)閴毫Ξa(chǎn)生去折疊現(xiàn)象，其保留會(huì)隨壓力的上升而增大。美國Merck實(shí)驗(yàn)室的Makarov等在UPLC柱與檢測器之間加一個(gè)可調(diào)節(jié)的背壓閥，在選定的流速與穩(wěn)定條件下使用UPLC-MS，通過氫-氘交換研究了超高壓力對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(去折疊)的影響。當(dāng)使用重水在45℃下孵育2h使蛋白質(zhì)樣品實(shí)現(xiàn)充分的氘交換，以普通水溶解的蛋白質(zhì)樣品作為對(duì)照，根據(jù)含重水流動(dòng)相和不含重水流動(dòng)相UPLC等度分離的結(jié)果，加上MS檢測樣品相對(duì)分子質(zhì)量的差異(即氘交換的質(zhì)量差ΔH)來評(píng)價(jià)壓力對(duì)蛋白質(zhì)中易于發(fā)生氘交換的活潑氫數(shù)量。結(jié)果顯示，壓力對(duì)存在α-螺旋的胰島素、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白樣品的影響明顯，其處于疏水內(nèi)區(qū)不易交換的氫的數(shù)量隨壓力增大而逐漸減少，而對(duì)不存在α-螺旋的血管舒緩激肽沒有變化。升高溫度到75℃可使胰島素和細(xì)胞色素C均完全去折疊失去疏水內(nèi)區(qū)而實(shí)現(xiàn)全部交換。實(shí)驗(yàn)中還觀察到從不同來源獲得的兩個(gè)牛胰島素批次之間蛋白質(zhì)折疊的微小差異。該文利用UPLC的壓力結(jié)合氘交換差異的質(zhì)譜檢測，使UPLC-MS成為研究蛋白質(zhì)折疊的方便工具，并可用于區(qū)分高級(jí)結(jié)構(gòu)差異的蛋白質(zhì)組分。McCalley最近總結(jié)了UPLC實(shí)驗(yàn)中壓力和摩擦熱對(duì)保留、選擇性、柱效影響的理論與實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展。通常壓力會(huì)增加樣品在反相HPLC中的保留，而且隨著分子增大，這種增大的幅度會(huì)更大。

　　HPLC流動(dòng)相的統(tǒng)一pH標(biāo)尺

　　如何比較HPLC中含有不同有機(jī)溶劑流動(dòng)相的pH一直是一個(gè)棘手的問題，德國KrossingI實(shí)驗(yàn)室曾以105Pa(1bar)氣相質(zhì)子絕對(duì)化學(xué)勢為基準(zhǔn)通過理論推算提出統(tǒng)一的絕對(duì)pH(pHabs)標(biāo)尺，理論上通過測定浸入兩溶液中pH電極的電位差可以直接比較兩溶液中溶劑化質(zhì)子的活度，但因?yàn)橐航与妱莸臏y定誤差而難以用于實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中。最近，其合作者愛沙尼亞的LeitoI實(shí)驗(yàn)室再次與其合作，借助IzutsuK對(duì)液接電位復(fù)雜的三分量計(jì)算方法，將其引入實(shí)際實(shí)驗(yàn)并得到一些常用甲醇和乙腈體系流動(dòng)相的pHabs值(參比為氣相)或pHH2Oabs值(參比為水溶液)，這些結(jié)果可用于直接比較不同有機(jī)相和緩沖液之類的流動(dòng)相的酸性。對(duì)于通常HPLC中的流動(dòng)相，根據(jù)流動(dòng)相中除去有機(jī)相后測定的pH(wwpH)與pHH2Oabs之間的單調(diào)變化的關(guān)系，可用內(nèi)插法通過測定wwpH得到其pHH2Oabs值。

　　滑移流(slipflow)現(xiàn)象緩解了超細(xì)粒徑UPLC柱壓并獲得更好的柱效

　　亞2μmUPLC及核-殼顆粒固定相的高速高效分離能力已被廣泛用于小分子分離分析。由于大分子擴(kuò)散系數(shù)小，傳質(zhì)阻力大，在蛋白質(zhì)分離方面仍有待改進(jìn)。由于“滑移流”的存在，使用更小的亞微米顆粒在蛋白質(zhì)分離方面可以獲得出乎意料的結(jié)果。美國普渡大學(xué)的WirthMJ實(shí)驗(yàn)室在亞微米與滑移流研究中取得了很多值得注意的結(jié)果。

　　多維高效色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法

　　對(duì)于復(fù)雜樣品的全分析，多維分離是有吸引力的研究方向。意大利MondelloL實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)表了在線LC-GC×ＧC-MS／MS方法，這被他們看成是一種五維方法(將三重四極桿質(zhì)譜看成二維的質(zhì)譜分離)。他們以煤焦油的二氯甲烷溶液為樣品，先用LC分離(100mm×３mm×５μm硅膠柱，以正己烷-二氯甲烷流動(dòng)相梯度洗脫，二極管陣列檢測)，將樣品分為非芳香烴、不飽和化合物、含氧化合物3組，并除去相對(duì)分子質(zhì)量太大的成分。再以該實(shí)驗(yàn)室已有的配有特制雙側(cè)端口進(jìn)樣針的AOC-5000自動(dòng)進(jìn)樣器作為LC與GC之間的接口，通過這個(gè)改進(jìn)的25μL進(jìn)樣針將LC餾分從檢測器出口轉(zhuǎn)移到GC×ＧC-MS／MS系統(tǒng)(由兩臺(tái)GC2010氣相色譜與一臺(tái)TQ8030三重四極桿質(zhì)譜組成)。

　　超臨界流體色譜中存在的甲硅醚

　　美國Waters公司的Fairchild等以3-苯甲酰吡啶和黃酮(flavone)為樣品，用耐堿的雜化硅膠柱(BEH)在超臨界流體色譜(SFC)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件(流動(dòng)相為CO2-甲醇(90∶10)，柱溫40℃，背壓調(diào)節(jié)器壓力2175psi)下分不開兩組分，但在柱中存在甲醇(且沒有水)的情況下兩峰會(huì)隨著色譜柱放置時(shí)間延長逐漸分開。固體NMR顯示固定相表面存在鍵合的甲氧基，證實(shí)柱中的硅醇基逐漸轉(zhuǎn)換成甲硅醚。而使用含水流動(dòng)相沖洗可以將其較快地還原為硅醇狀態(tài)。0.1%的N，N-二甲基丁胺可以雙向催化這個(gè)可逆反應(yīng)。異丙醇也存在類似的反應(yīng)但速度很慢。