國家藥監局器審中心發布《人KRAS基因突變檢測試劑注冊審查指導原則（征求意見稿）》，全文如下：

 

人KRAS基因突變檢測試劑注冊審查指導原則（征求意見稿）

 

本指導原則旨在指導注冊申請人對人KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene）基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的審查提供參考。

本指導原則是對該類試劑注冊申報資料的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。如注冊申請人認為有必要增加本指導原則不包含的研究內容，可自行補充。

本指導原則是供注冊申請人和技術審評人員使用的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料。需在遵循相關法規和強制性標準的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

 

一、適用范圍
本指導原則適用于采用核酸聚合酶鏈式反應（PCR法），對10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本中的KRAS基因突變狀態進行體外定性檢測的試劑。本指導原則以用于結直腸癌（CRC）患者的西妥昔單抗（Cetuximab）伴隨診斷的預期用途為例，闡述基于PCR法的KRAS基因突變檢測伴隨診斷試劑臨床前及臨床研究相關要求，對于聲稱其他伴隨診斷藥物、癌種及方法學的KRAS基因突變檢測試劑，申請人可參照本指導原則相關要求，根據產品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價資料。

KRAS是一種鼠類肉瘤病毒癌基因，由RAS家族成員基因編碼的一種GTP酶蛋白，參與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的信號轉導，調控細胞生長、分化、增殖和存活。人KRAS基因突變可影響基因的正常功能，引起細胞生長、分化失去控制，最終導致腫瘤的形成。導致KRAS處于激活狀態的突變主要位于基因2外顯子（第12、13位密碼子）、3號外顯子（第59、61位密碼子）、4號外顯子（第117、146位密碼子）號上[1]，包括多種突變類型。KRAS基因突變使癌癥患者對抗EGFR抗體類藥物產生耐藥[2]，進而不能從該類藥物治療中獲益，而KRAS基因野生型患者則可以從這類藥物中明顯獲益[3-5]。KRAS作為結直腸癌治療的分子靶標受到普遍關注，并已陸續開發出了西妥昔單抗等抗EGFR抗體類藥物。

針對用于結直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）患者的西妥昔單抗的伴隨診斷試劑，所覆蓋的突變位點應根據其不同突變位點的突變率設置，建議至少包括第2號外顯子的第12號和13號密碼子的7種熱點突變，包括G12D 、G12C、G12S、G12R、G12V、G12A、G13D。

本指導原則適用于人KRAS基因突變檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導原則針對人KRAS基因突變檢測注冊申報資料中的部分內容進行撰寫，其他未盡事宜應當符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等相關法規要求。

 

二、注冊審查要點

（一）監管信息

1.產品名稱及分類編碼

產品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規的要求，如人KRAS基因突變檢測試劑（PCR法）。根據《體外診斷試劑分類目錄》，與治療藥物靶點檢測相關的試劑和伴隨診斷用試劑，按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息

還包括產品列表、關聯文件、申報前與監管機構的聯系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產品描述、預期用途、申報產品上市歷史及其他需說明的內容。其中，與同類和/或前代產品的比較應著重從技術原理、主要組成成分、被測靶標（基因突變位點）、預期用途、性能指標、臨床應用情況等方面詳細說明申報產品與已獲批準的同類和/或前代產品之間的主要區別。預期用途應詳述KRAS基因突變與適應癥之間的關聯，藥物對不同KRAS突變類型的患者治療效果描述，提交相應支持性資料。

（三）非臨床資料

1.產品技術要求及檢驗報告

注冊申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據產品研制、前期評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻資料，結合產品特性按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求編寫。該類產品作為第三類體外診斷試劑，應當以附錄形式明確主要原材料以及生產工藝要求。

人KRAS基因突變檢測試劑已有適用的國家參考品，技術要求中應體現國家參考品的相關要求，并使用國家參考品對三批產品進行檢驗。

如有適用的國家標準、行業標準，產品技術要求的相關要求應不低于相應的要求。

2. 分析性能研究

注冊申請人應采用在符合質量管理體系的環境下生產的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數據、統計分析等詳細資料。

如申報產品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進行性能評估的資料。如申報產品包含不同的包裝規格，需要對各包裝規格進行分析或驗證。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、類型、數量、采集和處理方式、稀釋方式等。研究中采用的人KRAS基因突變FFPE樣本，應采用科學合理的方法確定其突變類型、突變序列百分率和人基因組DNA濃度水平，提交具體的試驗資料。如涉及樣本稀釋后檢測，應采用與適用樣本類型一致的陰性基質。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩定性

2.1.1樣本提取前核酸序列的穩定性

對于經福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本，通常較為穩定。申請人可依據相關專家共識及文獻，確定樣本的保存溫度及保存年限。一般而言，樣本保存年限不宜超過3年，以確保樣本質量及后續試驗的可靠性。

2.1.2樣本提取后核酸序列的穩定性

應檢測樣本提取后核酸的含量，設置反應體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度超過所需濃度上限或下限，應提供相應的改進措施?？刹捎米贤?可見分光光度計對DNA濃度進行定量，通過260 nm/280 nm處的吸光度比值（OD260/OD280）或其他方法評價其純度。同時，應對核酸提取物的保存時間、保存溫度進行驗證。并評價凍融次數、儲存條件等對樣本提取后核酸序列穩定性的影響。

2.2 適用的樣本類型

列明產品適用的樣本類型為CRC FFPE病理組織樣本。

2.3準確度

采用申報試劑與測序結果或已上市同類產品，同時檢測臨床樣本，比較檢測結果之間的一致性程度，進行申報試劑的準確度評價。

研究用樣本應納入一定數量的人KRAS基因突變型CRC FFPE臨床樣本和野生型CRC FFPE臨床樣本，并注意覆蓋產品檢測范圍內的每種突變類型樣本，并且應包含不同腫瘤分期（I-IV期）樣本、不同組織分型樣本、不同腫瘤組織含量樣本及干擾樣本。

2.4企業參考品驗證

根據主要原材料研究資料中的企業參考品設置情況，采用三批產品對企業參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數據。

2.5精密度

精密度評價應對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還應包括儀器、操作者、時間、地點、檢測輪次、試劑批次等，設計合理的精密度評價周期，并對批內/批間、日內/日間、不同操作者間和不同實驗室間的精密度進行綜合評價。

評價用樣本應為涵蓋產品檢測范圍內所有基因突變類型的FFPE臨床樣本，對于G12R、G12C等罕見基因突變類型，可采用FFPE細胞系、含有靶序列的核酸或質粒與人KRAS野生型CRC FFPE臨床樣本制備DNA存儲液進行精密度研究。試驗操作應按照說明書執行，需包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。樣本應至少包含3個水平：陰性樣本、檢出限水平樣本、中/強陽性樣本，并根據產品特性設定適當的精密度要求，例如：

陰性樣本：應包括人KRAS野生型樣本，陰性符合率應為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：陽性符合率應≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：反應體系中人基因組DNA濃度水平呈中度到強陽性，且突變序列百分率呈中到高百分比，陽性檢出率為100%且CV≤5%（n≥20）。

2.6檢出限

研究應包括擴增反應終體系中的突變序列百分率和申報產品反應體系中人基因組DNA濃度兩個因素。

2.6.1檢出限的建立

建立研究的樣本應包括涵蓋產品檢測檢測范圍內所有基因突變類型的FFPE臨床樣本，對于G12R、G12C等罕見基因突變類型，可采用FFPE細胞系、含有靶序列的核酸或質粒與人KRAS野生型CRC FFPE臨床樣本制備DNA存儲液。

研究應采用不同突變百分率及不同梯度濃度人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，將95%檢出率水平的突變百分率及人基因組DNA濃度，確定為產品檢出限。

KRAS基因不同突變百分率樣本混合應注意，每種突變類型樣本儲存液按照不同突變序列所占比例進行混合，應至少包括目標檢出限和檢出限上下至少各2個梯度比例范圍。對于按不同比例混合后的樣本，建議采用合理的方法驗證各樣本的實際混合比例。同時，在KRAS基因突變不同比例研究過程中應設置KRAS野生型樣本作為空白對照。

不同人基因組DNA量樣本混合稀釋應注意，使用的FFPE樣本應與待混合配置樣本類型相同。建議申請人設計一個顯著高于反應體系最高DNA加樣量的DNA濃度，在實際的KRAS不同突變比例下，進行不同梯度DNA濃度的檢測。不同梯度DNA濃度范圍應涵蓋申報產品反應體系中設定的最高DNA濃度和最低DNA濃度。

2.6.2檢出限的驗證

針對每種突變類型選擇不同于建立用臨床樣本，在已建立的檢出限水平進行驗證，建議對最低檢出限和檢測上限附近水平的樣本進行至少20次的重復檢測，應滿足95%以上檢出率要求。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應

該類產品主要與結直腸部位腫瘤存在較強關聯性，申請人在設計交叉反應研究時應將此點納入考慮。

申請人應考慮與靶序列的核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列的交叉反應。建議交叉反應驗證考慮以下因素：KRAS基因不同序列；RAS家族不同基因等；高濃度野生型人DNA樣本、非人類基因組基因、產品檢測范圍內各突變位點間的交叉干擾等。

非人類基因組基因樣本應包括可能產生交叉反應的常見腸道感染病原體、CRC組織獲取時易感染病原體等，如艱難梭菌、志賀氏菌、彎曲桿菌、耶爾森氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌等，需在有臨床意義相關濃度下進行檢測，細菌濃度水平建議至少106 cfu/mL，病毒濃度水平建議至少105 pfu/mL。

試驗方案需明確用于交叉反應驗證的樣本來源、制備方法、核酸序列確認和濃度選擇等，并提交詳細的研究資料。

2.7.2干擾研究

應針對可能的內源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。對于FFPE樣本，內源性干擾物質應包括血紅蛋白、甘油三酯、壞死組織等，外源性干擾物質應包括福爾馬林、石蠟、二甲苯、乙醇、蛋白酶K、常用治療藥物等。

干擾試驗可通過在所有突變類型檢出限水平處DNA存儲液中加入干擾物質的方式，評價干擾物質對目標基因檢測的影響，也可直接采用暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產生干擾的最高濃度。

2.8核酸提取/純化性能

石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間、核酸與蛋白之間發生交聯。因此，在進行核酸檢測之前，應有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還有盡可能去除PCR抑制物的純化作用。申請人需設置合理的評價方案（如：對同一CRC FFPE臨床樣本中段部分進行多份連續切片，等）和評價指標，評價樣本核酸提取過程的重復性。

無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率、提取過程重復性的研究，并評價該方法能否滿足KRAS基因突變檢測試劑的要求，提供詳細的評價資料。

若產品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行精密度、檢出限和抗干擾的驗證。

2.9反應體系

2.9.1樣本采集和處理

明確樣本的取材、固定、包埋、切片的具體要求，包括但不限于可檢測標本的類型、樣本離體后開始固定的時間、固定液的選擇、溫度要求、包埋條件、組織塊的厚度要求等。提供樣本處理的方法、步驟及參考的采集標準依據。

應確定樣本中的最低腫瘤細胞含量，提交確定方法及研究數據，腫瘤細胞所占比例需達到所用擴增檢測方法的要求。當樣本中腫瘤細胞含量低于標準要求時，如需采用樣本富集的方法來滿足腫瘤細胞含量要求，應提交詳細的樣本富集方法、步驟及研究數據，并對該方法所制備樣本進行精密度和檢測限驗證研究。

2.9.2核酸提取和反應體系

研究確定最佳核酸提取和反應體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTPs濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。明確每uL反應體系的DNA加樣量和總DNA濃度確定方法，建議在保證核酸提取質量的情況下盡量擴大總反應體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

如有多個適用機型，需提供每個適用機型基線和閾值的確定資料。不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

3. 穩定性研究

包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開封穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4. 陽性判斷值研究

陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測準確性的臨界值（Cut-off）。研究建議納入一定數量的臨床樣本，涵蓋人KRAS野生型和可檢測的不同突變類型，采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行研究，亦可采用其他科學合理的方法進行陽性判斷值研究。如果試劑判讀存在灰區，應提交灰區范圍確定的研究資料。提交陽性判斷值建立及驗證研究資料時，應包括研究方案、設定評價標準、研究過程以及研究原始數據等。其中，所用樣本的背景信息列表應至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構、檢測結果等信息。

5.其他資料

5.1主要原材料研究

此類產品的主要原材料應包括引物、探針、酶、dNTPs、核酸分離/純化組分（如有）、質控品、企業參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質量控制標準等相關研究資料、質控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、生產商提供的質量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。生產商應固定，不得隨意更換。

5.1.1 引物和探針：

應詳述每一待測位點檢測用引物、探針的設計原則，分別提供引物探針序列、靶基因序列及兩者的對應情況。建議設計兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點的檢測靈敏度和特異性等進行評價，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細的篩選研究數據。同時應針對引物、探針及檢測靶序列與公開數據庫進行同源性分析，如有同源序列應著重評價是否會有交叉反應。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質量評價，一般包括：外觀、分子量、純度、濃度、序列準確度、探針熒光標記基團，以及功能性試驗等，并依據評價結果建立合理的質量標準。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTPs）：包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP，應提交對其純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

5.1.3酶：主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等，應分別對酶活性、熱穩定性、功能性試驗等進行評價和驗證，并確定質量標準。

5.1.4質控品

試劑盒一般包含陰性質控品和陽性質控品。陽性質控品應包含較常見的突變序列或理論上較難測得的突變序列，可采用質粒、細胞系或臨床樣本的核酸提取液等進行制備。陰性質控品可采用含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可采用不含待測靶序列的空白對照，對交叉污染導致的假陽性結果進行質控。陰性質控品應參與樣本核酸的平行提取和檢測的全過程。提交試劑盒質控品有關原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質控品的檢測結果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內標

內標，又稱內對照，可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內標的引物、探針和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學設置內標，對待測樣本的取樣質量、試劑的反應體系進行監控。

5.1.6企業參考品制備

企業參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性參考品。應根據產品性能驗證的實際需要設置企業參考品。

常見基因突變位點建議采用臨床樣本提取的DNA儲備液作為原料，對于罕見基因突變類型可采用臨床樣本提取的DNA儲備液、細胞系或質粒作為原料。企業參考品基質應與樣本儲存液基質相同。應提交企業參考品的原料來源、選擇、制備、濃度、突變樣本突變類型及突變百分率的確認方法或試劑等相關驗證資料。企業參考品的設置建議如下：

陽性參考品：針對試劑盒檢測范圍內所有突變位點均應設置相應的陽性參考品，設置多個突變百分率梯度。

陰性參考品：應包括經確認無相應靶突變序列的樣本（如野生型人基因組，RAS家族不同基因型等）、非人類基因組樣本。

檢出限參考品：針對試劑盒檢測范圍內所有突變位點均應設置相應的檢出限參考品，其中每個突變位點應從擴增反應終體系總核酸濃度和突變序列所占百分率兩個方面進行評價，可選擇檢出限水平（例如：95%檢出率）或略高于檢出限的水平的樣本。

重復性參考品：應包括略高于檢出限濃度水平的陽性樣本、中或強陽性水平樣本、陰性樣本（野生型樣本），其中陽性精密度參考品以常見突變類型或理論上較難測得的突變序列為主。

5.2生產工藝研究
生產工藝研究資料主要包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記等工藝過程的描述及確定依據。生產過程應對關鍵參數進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。提交主要生產工藝的確定及優化研究資料。

（四）臨床評價資料

人KRAS基因突變檢測試劑針對結直腸癌適應證，預期用途為用于西妥昔單抗的伴隨診斷。針對該預期用途，KRAS突變一般為2號外顯子（密碼子12和13）、3號外顯子（密碼子59和61）以及4號外顯子（密碼子117和146）的突變。申報產品所覆蓋的突變位點，根據其不同突變位點的突變率，建議至少包括第2號外顯子的第12號和13號密碼子的7種熱點突變，包括G12D、G12C、G12S、G12R、G12V、G12A、G13D。如產品設計所檢測的突變位點少于以上位點，申請人應提供相關支持性資料，應根據突變位點的覆蓋率，充分分析合理性。

該類試劑應通過臨床試驗路徑進行臨床評價，臨床試驗包括產品臨床檢測性能研究和伴隨診斷試劑臨床意義研究兩部分。臨床試驗應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫療器械臨床試驗質量管理規范》和《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，如相關法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。

1.臨床檢測性能研究

1.1臨床試驗機構及人員

申請人應選擇不少于3家經備案的臨床試驗機構開展臨床試驗。臨床試驗機構應常規開展結直腸癌分子病理檢測，具有病理診斷、分子生物學檢測的優勢，試驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。臨床試驗整個過程均應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

1.2臨床試驗適用人群和樣本類型

適用人群為經病理診斷為結直腸癌的人群。應注意納入人群應覆蓋結直腸癌不同分期和不同組織分型（腺癌、腺鱗癌、鱗癌等）的病例。陽性樣本應包括一部分弱陽性的樣本。

臨床試驗所用的樣本類型應為病理質控合格的FFPE樣本。如對于活檢標本及手術標本均適用，則臨床試驗中對于兩種標本均應納入。臨床樣本的處理、保存和核酸提取等應分別滿足申報產品說明書及對比試劑說明書的相關要求。

1.3對比方法選擇

可選擇實驗室參考方法或已上市同類產品作為對比方法。參考方法的檢測可在臨床試驗機構完成也可委托具有資質的第三方機構完成。已上市同類產品的選擇應從預期用途、樣本要求、檢測性能、檢測范圍、所檢突變是否可以分型等方面，確認其與申報產品具有較好的可比性。

如選擇核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的對比方法，驗證申報試劑檢測結果與核酸序列測定（測序）結果之間的一致性情況，臨床研究報告中應對選用的測序方法作詳細介紹。

1.4臨床試驗樣本量

臨床試驗樣本量應采用適當的統計學方法進行估算，并詳細描述所使用統計方法及各參數的確定依據。此部分臨床試驗目的為評估兩種檢測方法之間的一致性，因此建議采用單組目標值法進行最低樣本量的估算。通過陽性符合率和陰性符合率來分別計算所需陽性樣本和陰性樣本的例數。樣本量估算公式如下：

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標準正態分布的分數位，P0為評價指標的臨床可接受標準，PT為申報產品評價指標預期值。

其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P0）建議不低于95%。臨床試驗結果中，相關評價指標的95%置信區間下限應不低于預設的臨床可接受標準。

基于申報產品的方法學為PCR方法，臨床試驗中應對所聲稱的每個突變位點均進行驗證，且每個突變位點均應具有一定的陽性病例。對于臨床罕見的突變位點，例數可酌情減少，申請人應提供相關的支持性資料。

臨床試驗總樣本量確定時應在上述陰、陽性樣本最低樣本量估算的基礎上，同時考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及申報產品所覆蓋的突變位點，根據實際情況適當增加入組樣本量。

1.5統計分析

首先應針對所入組人群進行人口學分析，包括性別、年齡、治療狀態、組織分型、分期、樣本類型、腫瘤細胞含量等方面進行分析，還應分析臨床試驗中所納入的陽性判斷值附近的樣本情況。

以四格表分別總結申報產品與對比方法的定性檢測結果，計算陽性符合率、陰性符合率及相應的95%置信區間。除總體統計外，還要針對每個突變位點進行統計分析，以驗證申報產品與對比方法檢測結果的一致性。

針對兩種方法檢測不一致樣本，應采用合理的方法進行確認，對不一致的原因綜合進行分析。

2.伴隨診斷臨床意義的確認

2.1臨床試驗機構數量

針對此部分臨床研究，申請人應選擇不少于3家按要求備案的臨床試驗機構開展臨床試驗。

2.2 臨床試驗設計及對比方法的選擇

因KRAS基因突變對于西妥昔單抗的伴隨診斷為負向位點，野生型可使用西妥昔單抗藥物。因此可采用一致性比對的方式進行臨床評價。

如申報試劑僅包括上述的7個熱點突變，可采用與原研伴隨診斷試劑進行比較研究，評價兩者之間的一致性。

如申報試劑包括KRAS 2號外顯子（密碼子12和13）、3號外顯子（密碼子59和61）以及4號外顯子（密碼子117和146）的突變，則可與西妥昔單抗藥物臨床試驗中所采用的CTA方法進行比較研究?？刹捎弥亟–TA的方式，應注意重建CTA的實驗流程、檢測性能應與CTA方法具有良好的一致性。

申報產品用于指導用藥的靈敏度應與原研伴隨診斷試劑相當，根據原研伴隨診斷試劑的靈敏度水平設置相應的陽性判斷值，以保證兩者具有較好的一致性。

2.3入組人群

此部分臨床研究的目的在于評價申報產品的伴隨診斷的預期用途，因此所入組人群應以西妥昔單抗藥物的適應證人群，即轉移性結直腸癌為主。

樣本量的估算方法與上述臨床性能評價中的樣本量估算方法相同，根據與原研伴隨診斷試劑的一致性水平設置合理的最低可接受標準。如原研伴隨診斷試劑同時能夠滿足對申報產品臨床檢測性能的評價，則此部分研究可與第一部分臨床檢測性能的評價進行合并，但應注意入組人群的差異。

此部分研究中應根據適應證人群中的基因突變率納入臨床常見的突變位點。

2.4 其他

如申報產品所伴隨藥物為其他藥物，則應根據伴隨診斷試劑相關指導原則的要求提供伴隨診斷證據。如申報產品為與新開發的抗腫瘤藥物同步研發的伴隨診斷試劑，則可提供與藥物同步開發的藥物臨床試驗資料作為其伴隨診斷證據。藥物臨床試驗報告中應明確所使用的伴隨診斷試劑為申報產品，并明確申報產品在藥物臨床試驗中所起的作用以及與藥物療效的關系。

3.通用要求

3.1臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構應執行同一臨床試驗方案，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申請人的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被剔除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。

3.2質量控制

臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗方案的培訓，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.3臨床試驗報告

臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法，最后得出臨床試驗結論。臨床試驗報告的撰寫應參考相關法規的要求。

（五）產品說明書和標簽樣稿

產品說明書格式應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求。產品說明書中技術內容應與注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。人KRAS基因突變檢測試劑說明書編寫應重點關注以下內容。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測結直腸癌患者經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本中KRAS基因第X號外顯子XX密碼子的X個突變位點（明確突變型別）。用于XX藥物的伴隨診斷。

1.2建議列表表述人KRAS多個基因突變型別，列明不同外顯子中基因突變的排列順序。至少明確產品外顯子、突變位點、cosmic ID、突變位點臨床意義及人KRAS基因信息所使用的數據庫。

1.3 人KRAS基因突變檢測的目標人群：

1.4申報試劑應伴隨特定腫瘤治療藥物聯合進行臨床試驗研究，并證明兩者伴隨使用具有顯著的臨床治療意義，說明書中需明確具體藥物通用名稱，并簡要介紹相關的臨床患者受益情況。

1.5應介紹相關的臨床背景，包括相關適用人群特征、腫瘤的組織類型、適用的樣本類型、待測靶基因序列的特征及選擇依據、靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發生、發展過程中可能起到的作用、相關藥物或其他治療技術及其作用機理、與待測突變位點可能存在的關系等。

1.6明確說明該試劑盒僅用于對結直腸癌患者靶基因序列的檢測，其檢測結果僅供臨床參考，不應作為患者個體化治療的唯一依據，臨床醫生應結合患者病情、藥物適應癥、治療反應及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有突變位點或突變類型、內標基因進行詳細描述（靶序列長度、基因座位、突變類型及相關特征等），對引物及探針設計、不同樣品反應管組合、質控品設置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。

2.2詳細介紹核酸分離/純化方法、原理等（如適用）。

2.3如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【樣本要求】重點明確以下內容：

樣本的采集、處理、運送和保存：明確對適用樣本的取材、固定、包埋的具體要求，可參考國內相關標準操作性文件內容進行編寫或引用。明確樣本中腫瘤細胞含量的要求，明確低于聲稱腫瘤細胞含量樣本的處理方式。明確樣本核酸提取/純化前的預處理過程、保存條件及期限、運輸條件等。

4.【檢驗方法】詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

4.1 FFPE組織樣本脫蠟過程，應分別描述封固于載玻片與未封固于載玻片（如有）的脫蠟步驟。

4.2試劑配制方法、注意事項。

4.3核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。質控品應參與樣本核酸的平行提取，以對核酸分離/純化環節進行合理的質量控制，明確提取核酸的濃度純度等質量要求。

4.4擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。

4.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置及相關注意事項。

4.6儀器及軟件設置：特殊參數，待測基因、內標和質控品的熒光通道選擇等。

5.【檢驗結果的解釋】

結合質控品、內標以及樣本管檢測結果的Ct值，以列表的形式對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。如存在檢測灰區，應詳述對于灰區結果的處理方式。

6.【檢驗方法的局限性】

6.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者個體化治療的選擇應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

6.2陰性結果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細胞過少、核酸過度降解或擴增反應體系中靶基因濃度低于檢出限亦可造成陰性結果。

6.3腫瘤組織（細胞）可能存在較大異質性，不同部位取樣可能會得到不同的檢測結果。

6.4不合理的樣本采集、轉運及處理，以及不當的試驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。

6.5明確該檢測僅限于規定的樣本類型及檢測系統（包括適用機型、核酸分離/純化試劑、檢測方法等）。

6.6本檢測試劑的檢測范圍僅包括檢測試劑聲稱的基因突變位點范圍，不包括檢測試劑盒聲明之外的基因突變位點的檢測。

7【產品性能指標】詳述以下性能指標：

7.1對國家參考品和企業參考品的符合情況。

7.2檢出限：說明在試劑盒規定的檢測條件及擴增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃度。重點考慮原始模板中基因突變的百分率和擴增終體系中核酸濃度兩個因素對最低檢出限的影響，并簡單介紹最低檢出限的確定方法。

7.3對精密度的研究情況進行總結。

7.4分析特異性

7.4.1交叉反應：詳述交叉反應驗證的基因類型、病原體種類，及有/無交叉反應的濃度水平。

7.4.2干擾試驗：說明驗證的干擾物質種類及有/無干擾反應的濃度水平。

7.5臨床試驗：簡要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結果和結論等。

8【注意事項】

8.1本產品僅用于體外診斷。

8.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

8.3試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導致性能變化，如保存運輸不當、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規范等，請嚴格按照說明書操作。

8.4生物安全防護相關內容。

8.5避免實驗室污染的措施。

 

參考文獻：

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