摘  要  Abstract 

 

近年來，藥品監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)對(duì)藥物中遺傳毒性雜質(zhì)的控制給予高度重視。鹵代烴類化合物是藥物中不可忽視的一類潛在遺傳毒性雜質(zhì)，其可通過多種途徑被引入到化學(xué)藥物中，或由藥物自身降解產(chǎn)生。有效控制藥物中的鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)，對(duì)于保障藥品質(zhì)量及用藥安全至關(guān)重要。本文對(duì)鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)的研究進(jìn)展進(jìn)行了較為系統(tǒng)的論述，介紹了鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生來源、毒性機(jī)制、控制策略、毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法，以及藥物中鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)檢測技術(shù)的新進(jìn)展，以期為鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)的評(píng)價(jià)與研究提供參考。

 

In recent years, regulatory authorities and pharmaceutical R&D institutions have placed increasing emphasis on the control of genotoxic impurities in drugs. Halogenated hydrocarbons represent a class of potential genotoxic impurities that may be introduced through various pathways or generated by drug degradation. Effective control of these impurities is essential to ensure drug quality and patient safety. This paper provides a systematic review of current research on genotoxic impurities of halogenated hydrocarbons, covering structure alerts, sources, toxicological mechanisms, control strategies, evaluation methods,and recent advances in detection technologies. The aim is to provide a reference for the evaluation and control of halogenated hydrocarbon genotoxic impurities in pharmaceuticals.

 

關(guān)鍵詞  Key words 

 

遺傳毒性；藥物鹵代烴類雜質(zhì)；毒性機(jī)制；毒理學(xué)評(píng)價(jià)；研究進(jìn)展

 

genotoxicity; halogenated hydrocarbon impurities; toxic mechanism; toxicological evaluation; research progress

 

 

遺傳毒性雜質(zhì)是指在較低水平下能夠直接或間接對(duì)遺傳物質(zhì)造成損傷的物質(zhì)，其對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷作用包括：DNA 鏈的斷裂、修飾與加合，基因突變及染色體畸變等[1]。細(xì)胞內(nèi)DNA 的損傷存在多種機(jī)制，可能由自發(fā)性、物理性和化學(xué)性等因素所引起，其中化學(xué)因素最為主要[2]。藥物中的遺傳毒性雜質(zhì)，多數(shù)為烷基化試劑。雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA 分子含有4 種堿基，分別是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，均為親核試劑。因此，親電的烷基化試劑能夠與親核的DNA 堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

 

警示結(jié)構(gòu)這一概念最早由Ashby 和Tennant 提出[2]， 含有這些結(jié)構(gòu)的化合物存在與DNA發(fā)生作用的可能性，進(jìn)而可能誘發(fā)癌癥。用警示結(jié)構(gòu)來提示雜質(zhì)可能的遺傳毒性，從而評(píng)價(jià)雜質(zhì)的致癌風(fēng)險(xiǎn)，逐漸得到了監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，有研究者總結(jié)出數(shù)十種具有致癌風(fēng)險(xiǎn)的遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)[3]，其中，多個(gè)警示結(jié)構(gòu)與鹵代烴類化合物有關(guān)[4]。同時(shí)，流行病學(xué)和對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的長期致癌性研究表明，鹵代烴類化合物可能與肝臟、胰腺、肺、腎臟、膀胱、神經(jīng)系統(tǒng)或淋巴造血系統(tǒng)癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[5-6]。

 

隨著相關(guān)雜質(zhì)研究的不斷深入，許多國家和地區(qū)監(jiān)管機(jī)構(gòu)充分協(xié)調(diào)各方意見，發(fā)布并逐步調(diào)整優(yōu)化相關(guān)指南文件。2002 年，歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA） 發(fā)布《遺傳毒性雜質(zhì)限度意見書》（Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities）， 后經(jīng)修訂于2006 年發(fā)布首個(gè)正式指南《遺傳毒性雜質(zhì)限度指南》（Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities）。2007 年，原國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》；2018 年， 原國家食品藥品監(jiān)督管理總局組織修訂了《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。2008 年， 美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）發(fā)布《遺傳毒性雜質(zhì)指南草案》（Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches: Draft Guidance）。2017 年，國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH） 發(fā)布《M7（R1）：評(píng)估與控制藥物中DNA 反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》[M7 (R1): Assessmentand Control of DNA Reactive(Mutagenic) Impuritiesin Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk] 指導(dǎo)原則。近年來，隨著各國和地區(qū)藥品監(jiān)管部門不斷提高對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的重視，對(duì)藥物中鹵代烴類化合物的檢測研究也日益深入。鹵代烴類化合物是一類重要的有機(jī)合成原料及中間體，其分類形式多樣，根據(jù)所連烴基的不同可分為鹵代脂肪烴、鹵代脂環(huán)烴和鹵代芳香烴；按鹵素種類可分為氟代烴、氯代烴、溴代烴及碘代烴；按鹵素原子數(shù)目可分為一鹵代烴、二鹵代烴和多鹵代烴。2023 年正式發(fā)布實(shí)施的ICH M7（R2）指導(dǎo)原則附錄3 中，新增了7 個(gè)化合物的可接受攝入量（acceptab leintake，AI） 或每日允許暴露量（permitted daily exposure，PDE），其中有3 個(gè)為鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)，見表1。鹵代烴類化合物是原料藥合成過程中的常用試劑之一，易在藥物中殘留，故應(yīng)重視對(duì)藥物中鹵代烴類雜質(zhì)的研究。

 

 

1 藥物中鹵代烴類雜質(zhì)的來源

 

藥物中鹵代烴類雜質(zhì)可由多種途徑引入，從其生命周期角度可分為兩類，即生產(chǎn)過程引入和儲(chǔ)藏過程產(chǎn)生。

 

鹵代烴類化合物在原料合成過程中可作為反應(yīng)試劑、溶劑、催化劑等。在合成原料藥物過程中，若原料純度不足或未反應(yīng)完全、反應(yīng)生成的中間體與反應(yīng)副產(chǎn)物在精制時(shí)未被完全除去，則易造成殘留而引入雜質(zhì)[7]。在制劑生產(chǎn)過程中，制劑工藝的選擇決定制劑過程中的藥物是否受水分、高溫或光照影響，若工藝選擇不當(dāng)則易造成藥物發(fā)生變化而引入雜質(zhì)。地塞米松磷酸鈉為地塞米松的水溶性鈉鹽，在其注射液處方中， 常加入亞硫酸鹽類抗氧化劑， 高溫條件下， 地塞米松磷酸鈉易與亞硫酸氫鈉發(fā)生親核加成反應(yīng)，生成鹵代烴類雜質(zhì)Ⅰ，故生產(chǎn)過程中，常采用非終端滅菌等工藝避免高溫影響制劑穩(wěn)定性[8]。周小華等[9] 在鹽酸莫西沙星注射液的質(zhì)量分析中， 采用液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC/MS） 推斷雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，并根據(jù)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及來源進(jìn)行總結(jié)歸屬。結(jié)果顯示，在其歸屬的12 個(gè)雜質(zhì)中，有7 個(gè)為工藝雜質(zhì)，其中有6 個(gè)為鹵代烴類雜質(zhì)，且采用同樣合成路線原料的企業(yè)產(chǎn)品，個(gè)別雜質(zhì)在含量上仍差別較大，說明除合成路線外，不同的工藝路線也是影響雜質(zhì)含量的重要因素。

 

原料藥物與輔料、包材的相容性在雜質(zhì)控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，直接影響藥品質(zhì)量。原料藥物與輔料、包材之間的相互作用可引發(fā)藥物發(fā)生水解、氧化、分解、異構(gòu)化、轉(zhuǎn)晶、聚合、霉變等變化，進(jìn)而產(chǎn)生雜質(zhì)。葡萄糖為祛痰藥鹽酸溴己新注射液的處方輔料之一，在溶液形態(tài)中，葡萄糖分子中含有的羥基易與溴己新結(jié)構(gòu)中的氨基發(fā)生縮合而產(chǎn)生鹵代烴類雜質(zhì)Ⅰ，且該雜質(zhì)含量與處方中葡萄糖的用量呈正相關(guān)[10]。在氨溴特羅口服溶液中，山梨糖醇作為甜味劑調(diào)節(jié)口味，在處方中用量大，糖醇類物質(zhì)在制備過程中易產(chǎn)生副產(chǎn)物甲醛，從而將甲醛帶入制劑，鹽酸氨溴索與甲醛易發(fā)生環(huán)合反應(yīng)產(chǎn)生特定鹵代烴類雜質(zhì)B[ 反式4-(6,8- 二溴-3,4-二氫喹唑啉-3- 基) 環(huán)己醇鹽酸鹽]，雜質(zhì)B 的含量與輔料中甲醛的含量呈正比，故在氨溴特羅口服溶液的開發(fā)中，應(yīng)嚴(yán)格控制原輔包中甲醛的含量以保證制劑穩(wěn)定性[11]。

 

2 鹵代烴類雜質(zhì)的遺傳毒性機(jī)制

 

鹵代烴類雜質(zhì)存在多種遺傳物質(zhì)致?lián)p通路，從作用方式來看，可分為直接作用與間接作用。直接作用是指鹵代烴類雜質(zhì)直接與DNA 相互作用，包括DNA 加合、DNA 交聯(lián)等過程，導(dǎo)致DNA 核苷酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致遺傳特征發(fā)生變化，造成DNA 損傷。間接作用是指鹵代烴類雜質(zhì)作為代謝激活氧化中間體或其代謝產(chǎn)物在不同的化學(xué)催化和酶催化體系中發(fā)揮致?lián)p作用，最終導(dǎo)致遺傳物質(zhì)受損。一般來說，遺傳毒性的潛能取決于鹵素的性質(zhì)、數(shù)量和位置以及化合物的分子大小[12]。當(dāng)鹵素位于具有活性的碳鏈末端，如常見的烯丙基位、芐基位或類芐基位，短鏈單鹵化烷烴和烯烴是潛在的直接作用烷基化試劑。二鹵代烴被鄰近取代或在短至中等大小烷基部分的兩端取代時(shí)，其烷基化作用也得到加強(qiáng)。完全鹵化的鹵代烷烴傾向于通過自由基或還原脫鹵成鹵代烯烴，進(jìn)而活化成環(huán)氧化物產(chǎn)生毒性作用；若鹵代烯烴的雙鍵位于結(jié)構(gòu)內(nèi)部或空間受阻，則能夠阻礙其環(huán)氧化，從而降低毒性[12]。

 

2.1 直接作用鹵代烴類雜質(zhì)

 

1,2- 二溴乙烷與溴乙烷都屬于與DNA 直接接觸的烷基化試劑，屬于多部位、多種屬的致癌物[13]。環(huán)氧氯丙烷對(duì)接觸部位有高度刺激性，其代謝產(chǎn)物雖會(huì)進(jìn)入體循環(huán)，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤僅發(fā)生在直接接觸部位，故推測其作用方式為直接作用[14]。靜脈注射α- 氯甲苯可導(dǎo)致小鼠DNA 加合物的形成，直接對(duì)遺傳物質(zhì)造成損傷[15]。

 

2.2 參與細(xì)胞色素P450代謝

 

鹵代烴類雜質(zhì)通過代謝物與細(xì)胞成分的生化激活和相互作用發(fā)揮主要毒性作用，此過程是由細(xì)胞色素P450 代謝鹵代烴而產(chǎn)生的反應(yīng)性中間體對(duì)生物靶標(biāo)產(chǎn)生攻擊[16]。鹵代烴的活化過程中，底物首先與細(xì)胞色素P450 結(jié)合，觸發(fā)其向高自旋態(tài)轉(zhuǎn)變，同時(shí)伴隨細(xì)胞色素P450 鐵中心的氧化還原電位升高，隨后發(fā)生電子轉(zhuǎn)移步驟，氧分子與活化后的鐵中心結(jié)合。在第2 次還原步驟后，氧分子發(fā)生均裂，推測形成高活性的類氧中間體，該中間體將氧原子插入底物，實(shí)現(xiàn)羥基化反應(yīng)，最終，羥基化的底物從酶活性中心釋放，完成催化循環(huán)[16]。

 

鹵代烴代謝過程中生成的中間體數(shù)量巨大，這些中間體是否發(fā)揮作用取決于其形成速率及對(duì)生物目標(biāo)的反應(yīng)性， 細(xì)胞色素P450 可能與這些新的中間體發(fā)生反應(yīng)[16]。根據(jù)細(xì)胞色素P450與鹵代烷烴和氧的相對(duì)反應(yīng)速率，代謝將通過羥基化途徑或碳鹵鍵的還原裂解進(jìn)行，烷基自由基形成后，可能在細(xì)胞色素P450 參與下，攻擊近端目標(biāo)或擴(kuò)散與氧反應(yīng)。鹵代烷基自由基在脫離酶活性中心前，會(huì)與血紅素氧復(fù)合物反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為過氧基形式，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。細(xì)胞色素P450 還原酶通過將血紅蛋白還原至亞鐵態(tài)，促進(jìn)過氧自由基接受電子生成過氧陰離子。該陰離子經(jīng)質(zhì)子化形成氫過氧化物，后者可發(fā)生兩類裂解，在電子轉(zhuǎn)移時(shí)形成的過氧陰離子預(yù)計(jì)會(huì)質(zhì)子化，氫過氧化物可能會(huì)分解，生成高反應(yīng)性烷氧基自由基或鹵代羰基化合物[16]。

 

2.3 代謝電子附著

 

在一項(xiàng)探究生物毒性作用機(jī)制的研究[17] 中，研究者提出存在一種酶充當(dāng)電子供體與鹵代烴絡(luò)合，引起鹵代烴的解離電子附著，這個(gè)過程導(dǎo)致其中一個(gè)碳鹵鍵斷裂，產(chǎn)生鹵碳自由基，而高活性鹵代烴自由基的產(chǎn)生是鹵代烴具有毒性的重要因素之一。在這種模式下，鹵代烴通過電子附著產(chǎn)生自由基的能力與自由基從脂質(zhì)中提取氫原子的能力發(fā)揮關(guān)鍵作用。鹵代烴通過電子附著形成自由基的傾向可通過垂直電子親和能（vertical electron affinity，VEA）確定，VEA 越高意味著對(duì)電子的親和力越大，形成有害自由基的傾向也越大。通過比較脂質(zhì)中的碳?xì)滏I強(qiáng)度與自由基從脂質(zhì)中提取一個(gè)氫原子時(shí)形成的分子中的碳?xì)滏I強(qiáng)度，可推測自由基從脂質(zhì)中提取氫原子的能力[18]。

 

2.4 通過芳香烴受體發(fā)揮作用

 

大量研究表明， 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中， 芳香烴受體（arylhydrocarbon receptor，AhR）介導(dǎo)了鹵代芳烴（如多氯二苯并對(duì)二噁英、多氯二苯并呋喃和多鹵代聯(lián)苯）的大部分毒性作用[19]。AhR 已被證明也存在于人體組織和細(xì)胞系中[20]。在嚙齒動(dòng)物中，AhR 是鹵代烴發(fā)揮毒性的主要媒介，而人類AhR 的一般功能與嚙齒動(dòng)物組織中的AhR非常相似[19]。AhR 與配體結(jié)合激活后，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成二聚體，進(jìn)而與DNA 上的AhR 反應(yīng)元件結(jié)合，以調(diào)控下游靶基因表達(dá)[19]。

 

特定二噁英異構(gòu)體或同系物的毒性強(qiáng)度與其對(duì)AhR 的結(jié)合親和力呈正相關(guān)，高親和力化合物表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物毒性[21]。通過C57BL/6J 與DBA/2J 小鼠的動(dòng)物及胚胎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，芳香鹵烴化合物二噁英與AhR 結(jié)合的親和力差異導(dǎo)致生物反應(yīng)曲線呈比例變化[19]。部分AhR 拮抗劑或激動(dòng)劑的化合物也已被證明可以抑制或降低強(qiáng)效激動(dòng)劑二噁英的毒理學(xué)或生化作用[22]。

 

3 遺傳毒性雜質(zhì)控制策略

 

2014 年，ICH M7 指導(dǎo)原則獲ICH 執(zhí)行委員會(huì)批準(zhǔn)，并被推薦給ICH 三方監(jiān)管機(jī)構(gòu)采納。ICH M7 指導(dǎo)原則吸收了EMA和FDA 發(fā)布的遺傳毒性雜質(zhì)相關(guān)法規(guī)內(nèi)容，是協(xié)調(diào)多方技術(shù)、具備可行性的指南標(biāo)準(zhǔn)，其最新一版ICH M7（R2） 指導(dǎo)原則于2023 年通過。2024 年1 月，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布公告[23]，要求從2024 年1 月3 日開始的相關(guān)研究需要按照ICH M7（R2）指導(dǎo)原則的要求完成對(duì)潛在致突變雜質(zhì)的研究和控制。ICH M7（R2）指導(dǎo)原則將遺傳毒性雜質(zhì)分為5 類，并提出了基本控制策略[24]，如表2 所示。

 

 

若化合物無動(dòng)物致癌數(shù)據(jù)或未得出劑量與反應(yīng)關(guān)系數(shù)據(jù)，使用毒理學(xué)關(guān)注閾值（threshold oftoxicological concern，TTC）的概念進(jìn)行常規(guī)限量控制， 但TTC 并非適用于所有的化合物，部分高潛能致癌物等不適用TTC進(jìn)行控制，且TTC 的推算是依據(jù)半數(shù)中毒劑量（median toxicdose，TD50）簡單線性外推，未考慮機(jī)體發(fā)生變化的其他情況，用于個(gè)別藥物雜質(zhì)限度控制不夠準(zhǔn)確。基于此，應(yīng)加強(qiáng)鹵代烴類雜質(zhì)的毒理學(xué)研究，以此為依據(jù)進(jìn)行限度控制。

 

4 遺傳毒性雜質(zhì)毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法

 

鹵代烴類雜質(zhì)的識(shí)別與判斷是其遺傳毒性評(píng)價(jià)研究中的難點(diǎn)，根據(jù)ICH M7 指導(dǎo)原則推薦，鹵代烴類雜質(zhì)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法主要可分為兩個(gè)階段。首先通過計(jì)算機(jī)構(gòu)建模型進(jìn)行化合物定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）分析，利用警示結(jié)構(gòu)預(yù)測化合物的遺傳毒性，在此階段需使用2 種預(yù)測原理互補(bǔ)的方法，分別基于專家知識(shí)規(guī)則與統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)則，若此階段未顯示雜質(zhì)可能具有遺傳毒性，則認(rèn)為該雜質(zhì)無致突變性，不建議進(jìn)一步檢測。其次，通過體外或體內(nèi)模型進(jìn)行進(jìn)一步毒性驗(yàn)證，常用試驗(yàn)方法包括細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)等，在實(shí)際應(yīng)用中，常使用一項(xiàng)體外模型與2 種體內(nèi)模型組合試驗(yàn)以全面評(píng)估雜質(zhì)的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。

 

4.1 體外評(píng)價(jià)方法

 

4.1.1 QSAR 模型

 

QSAR 是基于相似結(jié)構(gòu)化合物具有相似生物活性的原理，通過收集大量化學(xué)結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的生物活性數(shù)據(jù)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)工具構(gòu)建模型， 從分子水平理解微觀分子結(jié)構(gòu)與宏觀活性之間的關(guān)系，推斷影響化合物活性的關(guān)鍵因素，從而預(yù)測未知化學(xué)物質(zhì)的毒性[25]。陳朋宇等[25] 通過建立多氟烷基氧化物與過氧化物酶體增殖物激活受體-β（peroxisome proliferator-activated receptor-β，PPARβ） 結(jié)合親和力的QSAR 模型， 解析了全氟和多氟烷基物質(zhì)（per-andpolyfluoroalkyl substances，PFAS） 與PPARβ 結(jié)合從而產(chǎn)生脂毒性的構(gòu)效關(guān)系。蘭索拉唑氯化物是蘭索拉唑起始合成原料之一，為蘭索拉唑已知雜質(zhì)，張倩等[26] 選擇Derek 軟件和Sarah 軟件為模型，通過結(jié)構(gòu)預(yù)測蘭索拉唑雜質(zhì)的毒性。結(jié)果顯示，蘭索拉唑氯化物結(jié)果呈陽性，具有潛在遺傳毒性。后續(xù)通過斑馬魚模型和艾姆斯（Ames）試驗(yàn)進(jìn)行毒性評(píng)估，蘭索拉唑氯化物在所有雜質(zhì)中胚胎毒性最強(qiáng)且具有致突變性，將其歸為2 類遺傳毒性雜質(zhì)，需對(duì)其進(jìn)行含量控制。對(duì)蘭索拉唑原料藥及制劑中的氯化物進(jìn)行測定，對(duì)比結(jié)果顯示，制劑中氯化物含量較原料藥并未增加，說明制劑過程未引起氯化物的變化，該雜質(zhì)的控制需從合成源頭入手。

 

4.1.2 基于化合物親電性規(guī)則判斷

 

研究發(fā)現(xiàn)，大部分遺傳毒性雜質(zhì)是烷基化試劑，其化學(xué)基礎(chǔ)為親電性，而DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)中的4 種堿基均為親核試劑，故烷基化試劑能對(duì)DNA 中的堿基或磷酸二酯骨架上的氮原子或氧原子等進(jìn)行親電進(jìn)攻，從而造成DNA 雙鏈斷裂或空間構(gòu)象改變等結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而產(chǎn)生誘導(dǎo)突變、致癌等毒性[7,27]。例如，N- 氯乙酰-2,6- 二甲基苯胺為利多卡因的降解產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)中含脂肪族氯代基團(tuán)，電負(fù)性的氯使其鄰位的α- 碳原子易失電子形成親電基團(tuán)，該親電基團(tuán)易與DNA 等親核物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)， 產(chǎn)生基因突變[28]。

 

4.1.3 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

 

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)又稱Ames 試驗(yàn)，該試驗(yàn)以鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷突變株作為指示微生物，人工誘變的鼠傷寒沙門菌突變株在其組氨酸操縱子中有一個(gè)突變，突變株在無組氨酸的培養(yǎng)基中無法存活，必須依賴外源性組氨酸生長，誘變劑可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，從而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中也能生長，通過計(jì)數(shù)誘發(fā)的回變菌落數(shù)，可評(píng)價(jià)受試物的致突變能力及其原理[29]。其結(jié)果對(duì)靈長類動(dòng)物腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測率高達(dá)87.5%，被視為最可靠的遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)[30]。2-溴-3'- 氯苯丙酮（2-Bromo-3 '- chloropropiophenone ，BCP） 是合成安非他酮的中間體，也是抗抑郁藥鹽酸安非他酮的雜質(zhì)之一。Meng 等[31] 通過標(biāo)準(zhǔn)Ames 試驗(yàn)和TK6 細(xì)胞體外微核試驗(yàn)評(píng)估了BCP 的遺傳毒性， 結(jié)果顯示，BCP 經(jīng)S9 代謝激活后具有誘變作用，以濃度依賴形式增加突變頻率。同時(shí)，在體外微核試驗(yàn)中加入強(qiáng)抗氧化劑N- 乙酰-L- 半胱氨酸后其毒性降低，表明BCP 遺傳毒性作用可能是通過活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的。

 

4.1.4 染色體畸變?cè)囼?yàn)

 

染色體是細(xì)胞核中具有特殊結(jié)構(gòu)和遺傳功能的小體，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色體著色和形態(tài)分析，可以觀察到染色體缺失、重排、結(jié)構(gòu)異常等畸變情況。Parry[32]通過人類外周淋巴細(xì)胞觀察到1,2- 二溴乙烷能夠阻礙有絲分裂中紡錘體的形成，造成染色體異常。在此基礎(chǔ)上，Asita[33] 通過中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO） 細(xì)胞研究1,2-二溴乙烷對(duì)染色體的致畸變作用，結(jié)果顯示，1,2- 二溴乙烷能夠增加CHO 細(xì)胞中染色體畸變的頻率，且該作用具有劑量依賴性。

 

4.1.5 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)

 

小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（mouse lymphoma assay，MLA）可檢出包括點(diǎn)突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變?cè)趦?nèi)的多種遺傳改變。Mitchell、MyhR等[34-35] 采用小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK 基因突變?cè)囼?yàn)考察對(duì)氯苯胺的遺傳毒性，結(jié)果顯示，無論對(duì)氯苯胺是否經(jīng)S9 代謝活化，試驗(yàn)結(jié)果均呈弱陽性或陽性，這可能與對(duì)氯苯胺較高的細(xì)胞毒性有關(guān)。Clive 等[36] 研究發(fā)現(xiàn)，1,2- 二溴乙烷能夠誘發(fā)小鼠淋巴瘤L5178Y 細(xì)胞TK+/- 基因突變，在有或無代謝活化的情況下試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，證明其具有潛在的遺傳毒性。

 

4.2 體內(nèi)評(píng)價(jià)方法

 

4.2.1 轉(zhuǎn)基因突變?cè)囼?yàn)

 

轉(zhuǎn)基因突變?cè)囼?yàn)突破了體內(nèi)遺傳毒性評(píng)價(jià)方法僅使用造血組織為檢測終點(diǎn)的局限，可選擇靶向組織進(jìn)行突變檢測[37]。通過轉(zhuǎn)基因突變?cè)囼?yàn)可判斷遺傳毒性雜質(zhì)發(fā)生突變的靶器官，并對(duì)致癌性與致突變性的相關(guān)性進(jìn)行定量分析[38]。常用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型有Muta 小鼠、Gpt delta 小鼠和Big blue 小鼠等[38]。詹立等[39]以Muta 小鼠為模型，通過體外包裝反應(yīng)獲得并測試肝臟和肺中微囊藻毒素（Microcystin-LR，MCLR） 誘導(dǎo)的慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）基因突變頻率，并以突變噬菌斑的DNA 為模板進(jìn)行cll 基因序列分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中肝臟及肺組織的突變頻率均無顯著性差異，表明MCLR 在體內(nèi)未造成誘發(fā)點(diǎn)突變及染色體損傷。

 

4.2.2 磷脂酰肌醇聚糖A類（Pig-a）基因突變?cè)囼?yàn)

 

磷脂酰肌醇聚糖A 類（Pig-a） 基因突變?cè)囼?yàn)是通過檢測細(xì)胞表面糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）連接蛋白的表型缺失來評(píng)估雜質(zhì)的致突變能力，其檢測方法通常有流式細(xì)胞術(shù)和有限稀釋法[40]。基于流式細(xì)胞術(shù)的Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)可在對(duì)動(dòng)物損傷較小的情況下，在同一動(dòng)物上反復(fù)收集目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行檢測， 實(shí)現(xiàn)同一動(dòng)物個(gè)體突變水平監(jiān)測[41]。Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)符合ICH 相關(guān)技術(shù)要求，ICH M7（R2）指導(dǎo)原則中指出，當(dāng)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果呈陽性時(shí)，后續(xù)可結(jié)合Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)檢測直接作用的致突變物，進(jìn)行體內(nèi)相關(guān)性研究[42]。2,2',4,4'- 四溴二苯醚（BDE-47）是典型的多溴二苯醚同系物，You 等[43] 進(jìn)行小鼠灌胃給予BDE-47，持續(xù)6 周，采集小鼠尾外周血進(jìn)行Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)檢測，結(jié)果顯示，各劑量組均未產(chǎn)生陽性結(jié)果，表明BDE-47 不具有誘變毒性。

 

4.2.3 微核試驗(yàn)

 

微核是細(xì)胞質(zhì)染色質(zhì)團(tuán)塊，其外觀為小核，由染色體后期滯后或無中心染色體片段產(chǎn)生[44]。骨髓細(xì)胞中微核的發(fā)生與細(xì)胞遺傳學(xué)損傷有關(guān)， 骨髓涂片反映了受試物引起的染色體或有絲分裂器損失，故可通過觀測涂片計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞微核率，以此來檢測化學(xué)誘變劑造成的體內(nèi)損傷。當(dāng)細(xì)菌突變?cè)囼?yàn)在非S9 代謝活化條件下結(jié)果為陽性時(shí)，可選擇微核試驗(yàn)建立體內(nèi)外相關(guān)性。有研究以B6C3F1 小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，灌胃給予300 mg/kg.d劑量對(duì)氯苯胺， 給藥3 天后收集小鼠骨髓， 可見微核顯著增加，提示對(duì)氯苯胺具有致染色體畸變作用[44]。二甲氨基甲酰氯（dimethylcarbamoyl chloride，DMCC）在微核試驗(yàn)中顯示陽性結(jié)果，被判定為致癌物質(zhì)[44]。

 

4.2.4 大鼠肝臟非程序性DNA 合成試驗(yàn)

 

在細(xì)胞增殖過程中，DNA以半保留復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制， 當(dāng)其雙鏈結(jié)構(gòu)中一條鏈?zhǔn)軗p時(shí)， 細(xì)胞內(nèi)存在某種修復(fù)機(jī)制， 以另一條鏈為模板進(jìn)行修補(bǔ)， 該過程稱為程序外DNA合成（unscheduled DNA synthesis，UDS），被廣泛用于評(píng)估DNA 修復(fù)能力和致癌敏感性[45]。UDS 檢測方法主要有液體閃爍計(jì)數(shù)法和放射自顯影技術(shù)兩大類[45]。當(dāng)某雜質(zhì)僅在S9 代謝活化體系中顯示致突變陽性時(shí)，若該雜質(zhì)在試驗(yàn)物種肝臟中生成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物或可形成顯著的大分子加合物（如DNA 加合物），則可采用UDS 試驗(yàn)評(píng)估其體內(nèi)相關(guān)性。二溴乙酸（dibromoaceti cacid，DBA） 是氯化消毒的一種副產(chǎn)物，方城等[46] 采用UDS試驗(yàn)檢測DBA 的遺傳毒性，結(jié)果顯示，在大鼠肝細(xì)胞UDS 試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組放射性每分鐘計(jì)數(shù)（counts per minute，CPM）值相較對(duì)照組顯著增加，DBA 導(dǎo)致程序外DNA 合成增加，且存在一定的量效關(guān)系，表明DBA 具有明顯的DNA 損傷作用。

 

4.2.5 彗星試驗(yàn)

 

彗星試驗(yàn)是一種基于凝膠電泳的方法，可在單細(xì)胞水平上檢測DNA 損傷[47]。目前，彗星試驗(yàn)根據(jù)裂解液pH 的高低可以分為堿性彗星試驗(yàn)和中性彗星試驗(yàn)[48]。堿性彗星試驗(yàn)靈敏度較高，廣泛用于DNA 單鏈、雙鏈斷裂或堿基不穩(wěn)定位點(diǎn)的檢測[49]，尤其適用于通過形成堿基不穩(wěn)定位點(diǎn)或單鏈斷裂等導(dǎo)致突變形成的DNA前期損傷的化學(xué)結(jié)構(gòu)特異性作用模式。王倩等[50] 通過體內(nèi)彗星試驗(yàn)探索全氟辛酸的DNA 損傷特征，灌胃給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試物后，剖取動(dòng)物肝臟、外周血和骨髓并提取活細(xì)胞開展細(xì)胞彗星試驗(yàn)，結(jié)果表明，全氟辛酸未對(duì)骨髓、外周血和肝臟細(xì)胞DNA 產(chǎn)生影響，體內(nèi)無致DNA 斷裂作用。Takasawa 等[13] 利用體內(nèi)彗星試驗(yàn)檢測1,2- 二溴乙烷引起的DNA 損傷，結(jié)果表明，肝臟與胃細(xì)胞的尾DNA 百分含量顯著升高，彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，提示1,2- 二溴乙烷存在一定的DNA 損傷風(fēng)險(xiǎn)，具有潛在的遺傳毒性。

 

4.2.6 生物標(biāo)記物γH2AX

 

體外試驗(yàn)具有檢測潛在遺傳毒性因子的能力，但其特異性不足，無法充分建立體內(nèi)外相關(guān)性，或會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果[17]。ICHM7（R2）指導(dǎo)原則附錄中，強(qiáng)調(diào)將體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用于評(píng)估腫瘤誘導(dǎo)的可能作用方式。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，H2AX 組蛋白在絲氨酸139 位點(diǎn)（γH2AX） 迅速磷酸化，γH2AX 與DNA 損傷檢查點(diǎn)蛋白1 的介體（mediatorof DNA damage checkpoint 1，MDC1）之間的相互作用被認(rèn)為是DNA 損傷信號(hào)傳導(dǎo)和修復(fù)的第一步[51]，在DNA 損傷的感知和修復(fù)中起著核心作用。Nikolova等[52] 研究發(fā)現(xiàn)，γH2AX 法在檢測遺傳毒性化合物方面比彗星試驗(yàn)更為靈敏穩(wěn)定。Bryce 等[53]將67 種潛在遺傳毒性化學(xué)物質(zhì)在TK6 細(xì)胞中分別暴露4 h 與24 h，后使用含γH2AX 與磷酸化組蛋白3 生物標(biāo)志物的試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測生物標(biāo)志物熒光強(qiáng)度，γH2AX 熒光增強(qiáng)表明其致裂活性升高，結(jié)果顯示，該方法對(duì)67 種潛在遺傳毒性化學(xué)物質(zhì)的分辨率達(dá)95% 以上，同時(shí)有助于深入了解遺傳毒性作用方式和代謝激活之間的需求。

 

5 鹵代烴類遺傳毒性雜質(zhì)分析方法

 

鹵代烴類化合物廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)，在環(huán)境水體、食品、飲用水等方面的研究較為成熟[54-56]。鹵代烴類化合物也廣泛應(yīng)用于藥物合成領(lǐng)域，通常以痕量的形式存在于藥品中，因此對(duì)分離檢測技術(shù)的要求較高。

 

5.1 揮發(fā)性鹵代烷烴雜質(zhì)分析方法

 

對(duì)于具有揮發(fā)性的鹵代烴類化合物， 通常采用氣相色譜法（ gas chromatography ，GC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測[57-58]。江茹等[57] 采用GC-MS 法測定了阿替洛爾原料中的遺傳毒性雜質(zhì)環(huán)氧氯丙烷，檢測限可達(dá)0.0177 μg/ml。氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯、氯乙酸異丙酯是降糖藥物維格列汀的遺傳毒性雜質(zhì)，由合成過程中起始物料氯乙酰氯引入，常艷等[59] 通過GC-MS 同時(shí)測定維格列汀原料藥中上述3 種雜質(zhì)的含量，檢測限分別可達(dá)0.0072062、0.0073070、0.0072442 μg/ml。

 

5.2 非揮發(fā)性鹵代烷烴雜質(zhì)分析方法

 

對(duì)于非揮發(fā)性鹵代烴類化合物， 一般采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 配備不同的檢測器進(jìn)行檢測，如紫外檢測器[60]、質(zhì)譜檢測器[28,61]等。冼芷然等[62] 采用液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法測定了鹽酸利多卡因原料藥及注射劑中2,6- 二甲基苯胺和N- 氯乙酰-2,6- 二甲基苯胺的含量，并通過強(qiáng)制降解試驗(yàn)確定遺傳毒性雜質(zhì)的來源和降解途徑，評(píng)估了降解風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生產(chǎn)工藝提出了建議。1-(3- 氯苯基)-4-(3- 氯丙基) 哌嗪鹽酸鹽（雜質(zhì)F）是抗抑郁藥鹽酸曲唑酮的遺傳毒性雜質(zhì)，宋東偉等[63] 建立了LC-MS/MS 法測定鹽酸曲唑酮原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)F 的方法，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，檢測限可達(dá)0.005 ng/ml，可用于鹽酸曲唑酮中雜質(zhì)F 的檢測與控制，也可推廣用于檢測其他藥物如鹽酸奈法唑酮中的相同雜質(zhì)。

 

5.3 其他鹵代烷烴雜質(zhì)分析方法

 

對(duì)于不能直接測定或不穩(wěn)定的鹵代烴類化合物， 可以考慮采用衍生化法。楊海清等[64] 以苯胺為衍生化試劑， 在常溫下將氯乙酰氯衍生化生成2- 氯乙酰苯胺后，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）同時(shí)測定了他達(dá)拉非中的3 個(gè)潛在遺傳毒性雜質(zhì)。陳軼嘉等[65] 以甲醇為衍生化試劑，將利伐沙班中的雜質(zhì)5- 氯-2- 酰氯噻吩與甲醇酯化衍生為性狀穩(wěn)定的甲酯化物，并用GC-MS 建立測定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度與精密度高，耐受性與靈敏度好，可用于利伐沙班中遺傳毒性雜質(zhì)5- 氯-2- 酰氯噻吩的檢測與控制。

 

6 小結(jié)

 

近年來，遺傳毒性雜質(zhì)成為研究熱點(diǎn)，有關(guān)藥物中的遺傳毒性雜質(zhì)控制已經(jīng)得到藥品監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)的高度重視。鹵代烴類雜質(zhì)種類繁多，性質(zhì)差異較大，在藥物中含量通常較低，應(yīng)使用純度較高的物質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)研究，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。同時(shí)，鹵代烴類雜質(zhì)限度通常在100 ppm 以下， 對(duì)檢測儀器的靈敏度要求高，常規(guī)的檢測方法（如LC 法、GC 法）靈敏度較低，在一定程度上限制了其在遺傳毒性雜質(zhì)分析領(lǐng)域的應(yīng)用，常需選擇更為靈敏、快速、高分辨率的GC-MS 或HPLC-MS 法進(jìn)行測定。對(duì)于鹵代烴類雜質(zhì)的遺傳毒性評(píng)估應(yīng)從藥物的合成、生產(chǎn)及貯存過程入手，通過分析雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及理化性質(zhì)，結(jié)合文獻(xiàn)查詢、QSAR 評(píng)估，并選擇適宜的體內(nèi)外模型對(duì)其毒理性質(zhì)進(jìn)行考察，根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則中明確的不同類別雜質(zhì)AI 計(jì)算方法確定其合理限度。同時(shí)，建立起靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，逐步實(shí)現(xiàn)藥物中鹵代烴類雜質(zhì)的精準(zhǔn)檢測和有效控制。