工程化的活體單元可被視為哺乳動物細胞密集材料生物工程的關鍵構件，具有可用作組織工程或疾病建模應用的活體療法的良好特性。為了實現對細胞行為編碼的完全控制，由內而外的工程方法有可能完全釋放用戶定義的活體材料，這些材料具有量身定制的細胞功能和空間排列。在此，我們將討論基因工程策略帶來的最新進展和機遇，以及如何利用這些策略組裝富含細胞或基于細胞的下一代材料，從而實現對細胞排列和可定制治療功能的前所未有的控制。

01研究內容簡介

1、引言

哺乳動物活體材料正迅速成為復雜的活體療法以及組織工程和疾病建模應用的平臺。從根本上說，活體材料依賴于利用生命的基本單位--細胞--作為活體構件來進行生物工程，形成多尺度和富含細胞的組合體，這些組合體或僅由細胞組成，或與支持性生物材料以簡約模式相結合。與傳統的基于生物材料的平臺相比，活體材料具有顯著的細胞密度，使材料具有更高的生物復雜性、生物功能性、成熟性和響應性。利用材料科學傳統的自上而下的方法和新興的自下而上的工程策略，對 “由外而內 ”的工程策略以推進分層活體結構的制造。例如，這些活體結構通常通過以下方法獲得：(i)重塑細胞外環境，(ii)控制微組織沉積，或(iii)細胞表面工程，從而在活體構建物的組裝階段實現一定程度的自由。事實證明，這種活體結構對解決特定的醫療應用問題特別有意義，如加速血管生成或特定組織修復（如皮膚、心臟或骨骼）。然而，外入策略的物理化學線索無法確保細胞分布、命運和功能的高時空分辨率，從而限制了對活體組裝生物行為的控制。此外，智能材料和外源生長因子無法控制特定的細胞內通路，阻礙了哺乳動物細胞的精確編程。

另一方面，利用基因工程和合成生物學工具箱，由內而外地設計細胞命運，已成為精細控制哺乳動物活體系統制造的另一種方法，隨著時間的推移，對細胞單位的控制程度更高。從機械學的角度來看，活細胞單位可被視為微型機器，等待用戶定義或微環境誘導的生物計算指令。利用可切換的遺傳電路對細胞構件進行編程，可實現對細胞行為的高時空控制，并提高可預測性。此外，新出現的基因組編輯技術現在可用于以前所未有的精確度對哺乳動物基因組進行永久性操作。因此，可能有必要使用基因策略來確保活體組合內的動態生物特征，如細胞自主性、免疫調節、復雜的細胞-細胞通信途徑和可誘導行為。通過將這兩種框架（由外而內和由內而外）協同結合起來，我們有望迎來哺乳動物活體材料的新時代，這種材料可以按需組裝和編程，具有可調整的行為和功能。

我們使用“機器 ”一詞，是為了強調其結構的復雜性與內在的機械遺傳可編程性，以驅動細胞執行用戶編碼的功能。在這篇綜述中，我們將重點探討基于基因的工程策略在由內而外推動下一代生物材料發展方面的前景。本文展示了為協調多細胞哺乳動物系統的自組織和生物功能所做的顯著努力，即有機體、合成組織、生物機器人以及智能治療人工生物植入物。展望未來，我們認為基因工程哺乳動物活體材料可以具有越來越高的生物復雜性、多功能性和適應性。最終，這些可能會為生物工程和個性化醫療保健應用開辟新的領域。

2、基因工程細胞活單位

目前，“由外而內 ”策略在生成活體結構方面具有特別重要的價值，可應用于多個生物工程領域（如疾病建模、藥物測試、組織修復等）。自下而上策略和生物工程工具（如代謝糖工程、共價鍵合等）的進步使人們能夠初步控制細胞單位自組裝成活結構的過程。除此之外，利用各種基因工程工具箱（圖1），還可以對哺乳動物細胞的活體單元進行由內而外的精心重新布線。利用目前可用的這一龐大工具箱，我們可以設想，不僅在組裝過程中，而且隨著時間的推移，都可以對細胞進行基因工程改造和操縱，從而加強對細胞組織和所生成活體結構行為的時空控制。盡管對基因編碼質粒或mRNA 的瞬時傳遞進行了廣泛研究，以重塑細胞單位的行為和生物活性，但將整個轉基因盒永久穩定地整合到基因組中也可能有助于創造新一代的細胞和基因療法。轉基因的穩定整合在體外細胞工程中尤為重要，一般可通過病毒載體（如逆轉錄病毒或慢病毒）或轉座子以完全或半隨機的方式實現。

另一方面，特異位點基因編輯工具近年來迅速崛起，從早期的Cre重組酶、鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活劑樣效應核酸酶（TALENs），發展到今天著名的基于CRISPR的編輯器。這些精確的工具幾乎可以針對任何基因組位點，實現特定位點的基因敲入/敲出，并在已知的基因組安全港（如 AAVS1 或 CCR5）內整合轉基因。此外，尖端的堿基和質粒編輯器使基因編輯應用更可靠、更安全，同時對細胞的毒性最小。除此之外，基于 CRISPR 的工具箱還可用于表觀基因組工程，主要是在不改變基因組的情況下調節基因轉錄 。在這一領域，迄今已開發出不同的工具集，即 CRISPRa/i 或   CRISPRon/off 平臺，利用失活的核酸酶、轉錄激活或抑制結構域以及染色質修飾劑 。

在過去十年的組織工程中，使用合成生物學方法對哺乳動物細胞進行編程越來越受到關注，特別是在實施定制基因電路以指導細胞行為方面。例如，設計細胞可以感知用戶定義的輸入，對其進行處理并做出反應 。開環基因開關需要用戶定義對內源性或無跡物理線索（如小分子、光、熱或聲音等）的響應能力，而閉環反饋裝置則能按需響應生理線索，如與疾病相關的生物標志物。此外，合成生物學家迄今為止還設計了許多細胞表面合成受體，用于觸發定制信號級聯，如 CARs 、synNotch、Tango   、MESA 、Cha-Cha 或 GEMS。

根據一系列邏輯運算（即 AND、OR、NOR 或 NAND ），分層布爾邏輯門電路也可用于促進對刺激性細胞的精細控制，這在新興的   CAR-T 細胞工程中得到了廣泛探索。上述基因裝置的發展往往需要設計-構建-測試的反復循環，利用不同的分子克隆技術（如   Gibson 組裝、Gateway 克隆等），結合熒光激活細胞分選（FACS）、PCR 和 DNA   測序步驟。到目前為止，遺傳細胞工程的主要重點還包括優化向哺乳動物細胞輸送此類遺傳機制。人們在定制物理方法（如電穿孔）以及病毒和非病毒系統（如肽、脂質或聚合物）方面付出了巨大努力 。因此，近年來這些新興的基因工程和合成生物學工具箱大大推進了細胞重編程的應用。

從這些突破中汲取靈感，顯然已經出現了一股新的生物工程浪潮，即對哺乳動物活體材料進行基因工程改造，使其具有增強的生物功能和復雜的結構（圖 1）。這些努力引發了突破，并促進了組織工程師和合成生物學家的合作，下文將對此進行展示。

Fig. 1. Illustration of genetically programming mammalian cell living building blocks for bioengineering complex living systems. (i) Inside-out cell engineering strategies include major transposon and viral vectors, as well as site-specific CRISPR-based genome and epigenome editors, in which proficient delivery systems are key for efficiently delivering such apparatus into the cells. (ii) Inducible synthetic biology-inspired gene circuits are key for controlling cell behavior. This can be attained by exploiting designed synthetic receptors, closed-loop circuits responsive to exogenous stimuli (e.g., light, small molecules, sound), and open-loop feedback circuits responsive to specific physiological   cues. Logic gated circuits are also key for achieving cellular biocomputing programmability. (iii) In parallel, downstream analysis and intelligent   design approaches aid in the efficient and rapid development of such engineering toolboxes, harnessing emergent artificial intelligence algorithms, next-generation genome sequencing, cell sorting strategies, and   molecular cloning. (iv) At a cellular level, different living behaviors can   be meticulously controlled, including on-demand synthesis of specific biomolecules, cell fate and differentiation, proliferation and migration, as   well as cell-cell communication and gene expression patterning. (v) For   fabricating truly living mammalian systems, inside-out engineering can be   interfaced with outside-in engineering approaches (e. g., materials science,   biofabrication and tissue engineering), for developing complex designer constructs with high biofunctionality and spatiotemporal programmability.  Organoids, spheroids, vascularized constructs, cell sheets, programmable cell-dense assemblies and microtissues, dynamic bioactuators and bioinks can be engineered for human therapeutics, regenerative medicine, disease   modelling, and soft robotics.

3、推進基因定制哺乳動物活體材料

基因工程哺乳動物活材料最近出現在廣泛的生物醫學應用中，將組織工程平臺提升到具有定義程序的復雜生物構建體。通過探索此類工具，可以從內到外對細胞進行編程，以隨著時間的推移調整其行為，例如允許研究人員：（i）塑造組裝的生命結構的架構和功能和/或（ii）編碼生命療法中的智能特征，如將在以下子章節中展示的。

3.1塑造多單元組件的架構和功能

在合成組織發育和形態發生方面，有機體可被視為三維自組織實體。這些實體一般可以來自人類胚胎干細胞（hESC）、誘導多能干細胞（hiPSC）或成人干細胞（hASC）。這類生物微組織可真實再現人體組織的早期發育狀態或功能，也可作為獨特的體外疾病建模平臺。為了克服生物工程方面的挑戰，從根本上構建越來越多的生物仿真類器官組織，近年來出現了各種基因引導的類器官組織（圖 2）。早期的嘗試是利用轉錄因子 GATA6 的多克隆誘導表達來組裝復雜的胎兒肝臟類器官，其表型可再現人的芽和血管樣。

在一種優雅的方法中，探索了信息計算轉錄組學分析，通過過度表達關鍵轉錄因子（即 ATF5、PROX1）和基于   CRISPR 的特定酶（即細胞色素 P450 3A4 (CYP3A4)），合理設計出具有優良肝臟特征和血管性的成熟結構。值得注意的是，血管結構在器官的器官發生、命運成熟和模式化過程中起著關鍵作用 。通過誘導轉錄因子 ETV2 的表達，研究人員還能從基因上引導 hESCs 衍生的大腦和hiPSCs 衍生的腎臟器官組織中血管網絡的建立。在后者中，廣泛內皮化的產生是驅動具有人源化細胞池的類似本地多線腎臟成熟的關鍵，由此產生的器官組織中含有成熟的莢膜細胞、間質細胞和腎素細胞（圖 2A）。還可以探索合成類似于組織器的信號中心，以對器官組織的自組織進行編程。通過化學方法誘導胚狀體（EBs）中長程信號Wnt/β-catenin的極化激活，或腦組織器官中Sonic Hedgehog（SHH）通路的極化激活，可以模擬體內早期組織發育過程，獲得圖案化的拓撲結構。另外，光遺傳學電路已被用于時空協調具有仿生人類神經發育特征的 SHH 模式和極化腦有機體（圖 2B）。通過將光誘導遺傳模塊與單細胞和空間轉錄組學相結合，研究人員可以確定此類構建體的模式特征。如前所述，精確引導這種三維組織變形的能力反過來又有助于在哺乳動物系統中塑造復雜的結構。作為概念驗證，研究人員發現了一種利用光遺傳學可逆折疊神經器官組織的方法，即利用脊椎動物形態發生過程頂端收縮的關鍵調節因子 Shroom3。例如，可以實現多種三維組織變形，包括增厚、扁平和管腔收縮，再現哺乳動物的三維動態形態發生過程（圖 2C ）。最后，可以利用最先進的基因編輯工具箱，通過準確再現與某些疾病相關的特定基因組突變或基因變異，生成先進的等基因體外人類疾病模型。例如，目前已開發出基于電穿孔堿基和質粒編輯生成同種異源 ASC 肝細胞、子宮內膜和結腸類器官系的熟練而多用途的方案。

Fig. 2. Strategies and tools for genetically guiding   the self-organization and maturation of next-generation organoids. A)   Inducible, vascularized human kidney organoid. Top left: Schematic of   PiggyBac-engineered dox-inducible ETV2-human induced pluripotent stem cell   line (iETV2-hiPSC). Bottom Left: Representative immunofluorescent platelet   and endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1) images of endothelial cell   network in vascularized and control kidney organoids; Images showing   emergence of a renin (REN) cell population in vascularized kidney organoid,   and no REN+ cells in control. Right: Vascularized kidney organoids   with GFP+ endothelial cells encasing the podocyte clusters from   the external surface. Reproduced with permission. Copyright 2024, Elsevier.   B) Optogenetic patterning of a human neural organoid. Top left: Schematics of   light-inducible transcription activation module (SCPTS), based on a dCas9   fused to transcription activation domains, driving CasRx transcription; A U6   promoter-driven CasRx guide RNA can be co-expressed. Bottom left: Schematics of PiggyBac-engineered dox and light-inducible Cre-Lox system, based on a split Cre fused with pMag-nMag photodimers. Top right: Spatial   photostimulations by a LED array, in which images represent an organoid (4–12 days), locally photostimulated via laser scanning. Bottom right: Optogenetic stimulation of SHH in neural organoids, coupled with spatial readouts, in which images represent SHH-expressing cells in adjacent cryo-sections of   organoids with laser induction of SHH in the north-west pole. Reproduced with   permission. Copyright 2023, Springer Nature. C) Optogenetic control of apical constriction in a human neural organoid for induced tissue deformation. Top   left: OptoShroom3 genetic constructs, based on dimerization of Shroom Domain   1 (SD1) and Shroom Domain 2 (SD2) upon blue light illumination; Schematics of formation and stages of mouse optic vesicle organoids regarding   OptoShroom3-induced tissue deformation. Bottom left: Images of Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells expressing SspB-mCherry-CShroom3 before and after 1 min  stimulation; Images of organoid thickness before and after stimulation. Top right: Optic vesicle organoid and stimulation cycles, altering the lumen diameter of optic vesicles. Bottom right: Images of OptoShroom3-induced flattening through local stimulation of neuroectodermal organoids. Reproduced with permission. Copyright 2022, Springer Nature.

除了干細胞衍生的自組織系統，人工遺傳程序也可用于自下而上構建預編程的合成多細胞組合（圖3）。受在胚胎發育過程中發現的圖靈模式（如斑馬皮膚條紋）的啟發，可以探索反應擴散數學模型來塑造哺乳動物的模式（即誘導斑點或條紋等）。通過操縱 Nodal-Lefty 信號通路（胚胎形態形成的關鍵），可以重建激活劑-抑制劑基因回路，誘導短程 Nodal 激活劑的正反饋和長程 Lefty 抑制劑的負反饋。此外，細胞粘附分子（如粘附素）也可以通過策略性操作來引導基于細胞粘附的模式。例如，基于粘附素的細胞分揀系統的化學遺傳回路可在帶有不同表達的粘附素類型的細胞聚集體中誘導出二維和三維條紋圖案。最近，人們探索了一種 synNotch 受體系統，該系統以并列信號受體 Notch 的核心調節結構域為基礎，與一個嵌合的細胞外識別結構域和一個嵌合的細胞內轉錄結構域相連接，從而推動了合成哺乳動物源對稱>非對稱組織樣結構的產生（圖 3A）。因此，synNotch 能夠生成定制的遺傳程序，通過細胞間通信和合成信號級聯控制粘連蛋白的表達，從而實現多層圖案化小鼠成纖維細胞衍生球體的生物工程（圖 3A）。通過細胞信號交互和誘導形態重排的循環邏輯序列，可以實現多細胞自組織的迭代改進。

synNotch 的可重現性和可定制性證明了它在自下而上組織工程學方面的巨大潛力，后來它又被重新設計用于檢測可溶性合成形態發生因子。在另一種方法中，為了增加復雜的結構，設計了用于編程圖案形成的 helixCAM 平臺。該系統基于表面呈現的與跨膜結構域融合的卷曲肽，能夠在人類白血病細胞中制造出不同的多細胞聚集體，包括五層球形集合體，并能操縱細胞的遷移和形態。此外，Lim 實驗室最近還通過將正交的胞外結合結構域與原生的胞內結構域相結合，生成了新型合成細胞粘附分子（synCAMs）（圖 3B）。在這一策略中，synCAMs   可用于決定細胞形態和細胞骨架結構以及可定制的細胞-細胞模式。此外，這些工具還可用于組織重塑：(i) 將不同的細胞群整合到單一的球形結構多細胞結構中；(ii) 使成纖維細胞球體和上皮單層之間自我重塑和融合成復雜的格子狀組織網絡（圖 3B）。未來，這種基因編程結構可加速組織工程和修復的復雜平臺。此外，基因回路還可用于在單一細胞類型中精確編程不同的細胞狀態。利用鋅指轉錄因子，MultiFate 平臺可在外部小分子的調控下不可逆地引導多達七種不同的細胞狀態。此外，還探索了一種隨機重組酶基因開關，用于從單克隆群體中誘導具有可調亞群比例和三維形態的下游命運。最后，還出現了不同的光遺傳學電路，用于將細胞構件組裝成組織。例如，E-cadherin 光平臺可對   E-cadherin介導的細胞-細胞粘附和肌動蛋白細胞骨架組織進行時空遠程編程，從而引導多細胞聚集和遷移（圖 3C）。有趣的是，重復的開-關（暗/藍光）切換周期可用于促進對細胞組裝的動態和可逆操作。此類技術可加速研究具有復雜程度的自下而上的多細胞集合體，使哺乳動物生命系統更具活力和仿真性。

Fig. 3. Bottom-up genetic programming of synthetic   multicellular assemblies. A) synNotch-based programming of cell assemblies.  Left: Schematics of three-layer circuit, in which an A-type cell sends   signals to a B-type cell using CD19 ligand, inducing high expression of E-cadherin and GFP; Induced B-type cell then sends reciprocal signals to A-type cell, and GFP serves as ligand to stimulate anti-GFP synNotch receptor expressed in A-type cell; In the bottom, cell fate diagram showing how the process evolves, self-organizing into three distinct cell phenotypes   organized into three spatially distinct compartments; Images of spheroids   development with a three-layer architecture, from 0 to 20 h. Right: Representative schematics of different self-organizing multicellular structures programmed via synNotch toolsets. Reproduced with permission. Copyright 2018, American Association for the Advancement of Science (AAAS). B) synCAM-based multicellular assembly and tissue remodeling. Top left:   Schematics of functional roles of cell adhesion and design of synCAM   receptors, in which the extracellular domain of a CAM is replaced by GFP and   a GFP-binding nanobody (anti-GFP). Top right: Custom heterotypic assemblies with alternating, bridging, and cyclic patterning, with L929 cells expressing synCAMs. Bottom left: Exploitation of synCAMs technology to force the   integration of differentially sorting L29 populations, leading into a binodal   structure. Bottom right: L929 cells mixed with an epithelial MDCK monolayer, initially forming spheroids on top of the monolayer, and later converging   into a complex lattice-like network, after the introduction of GFP-anti-GFP   synCAMs, thus reshaping tissue organization. Reproduced with permission. Copyright 2022, Springer Nature. C) Opto-E-cadherin-based reversible   programming of cell-cell adhesions. Top left: Schematics of Opto-E-cadherin   platform, in which cells that express opto-E-cadherin on their surfaces form cell-cell adhesions in the dark but not with blue light; LOV2 domain is   inserted between the first and second extracellular domains E-cadherin in   proximity to one of the calcium binding sites. In the dark, the Jα-helix of the LOV2 remains folded such that the Ca2+ ions can bind and the   E-cadherins on neighboring cells interact. Under blue light, the Jα-helix unfolds such that the Ca2+ ions cannot bind and the E-cadherin interactions are lost. Bottom left: Images showing Opto-E-cadherin-MDA cells after 4 h in the dark (aggregated) or under blue light. Top left: Brightfield images of opto-E-cadherin-MDA cells in suspension culture under repeated 60 min dark/blue light cycles and their clustering dynamics, showing temporal and bidirectional control over cell-cell adhesions. Bottom middle:Fluorescence images showing light-controlled actin cytoskeleton reorganization in the dark or under blue light in 2D cultures, with F-actin   (red), nuclei (blue), and p120 (yellow) staining. Bottom right: Bright field   images of opto-E-cad-MDA cells in a wound healing assay in the dark and under blue light for 16 h. Reproduced with permission. Copyright 2022, Springer Nature.

合成生物學與材料科學的融合確實可以推動組裝出越來越多的可擴展活體結構（圖 4）。例如，synNotch 技術最近已升級為一種用途廣泛的材料-細胞可編程工具，可通過用戶定義的基因表達模式和細胞命運，在空間上控制組織結構。不同的生物材料，如細胞產生的細胞外基質蛋白和水凝膠，都可以用合成配體（如 GFP 和 mCherry）來設計（圖 4A）。此外，用 GFP 和 mCherry 配體雙重圖案化的微流體基底還能使雙系受體成纖維細胞選擇性地同時共轉分化為成肌細胞系和內皮細胞系。這種雙重分化可在具有定制組織模式幾何形狀和排列的連續組織結構中誘導，而無需添加可溶性分化因子。未來，這種技術可與細胞密集型生物墨水相結合，用于構建三維生物打印大尺度圖案構建體，甚至用于自我協調器官組織的成熟。值得注意的是，三維生物打印技術已經開始與設計細胞相結合，以實現對活體結構的復雜控制。在最近的一項研究中，利用由多克隆誘導轉錄因子 hiPSCs 組成的生物墨水組裝多細胞神經組織結構。這種方法可使用戶定義的神經干細胞、內皮細胞和神經元在錯綜復雜的分層結構中共同分化，模擬原生組織。從更高的角度來看，對生物打印組合體進行遠程時空遺傳控制可能特別有趣。在這方面，最近通過將嵌入式擠壓體積打印與光遺傳工程細胞相結合，開發出了厘米級的細胞密集合成微凝膠。

這種小尺度組織具有光觸發胰島素分泌的胰腺β樣細胞的指定模式，展示了高功能微凝膠。此外，通過在具有可灌注通道網絡的生物打印水凝膠中裝載熱誘導細胞，研究人員設計出了 HEAT 平臺--用于啟動轉錄的熱交換器（圖 4B）。從本質上講，可以利用這些平臺實現對三維打印人工組織中體積熱誘導基因圖譜的深度和規模靈活控制，并具有空間和時間可調性。這種策略對未來組織工程和再生醫學的應用可能很有意義。在其他方法中，基因程序被進一步用于組裝類似機器的活體材料，這些材料具有驅動、類似生命的運動或甚至非自然的特征，有可能推動具有用戶編程功能的軟生物混合機器人新時代的到來。在過去幾年中，人們設計了多種光遺傳學電路，用于在堅固的合成結構中控制肌肉組織收縮。例如，這種電路可以遠程編程骨骼生物機器人的多向行走能力，以及功能神經肌肉單元內的鞭毛動態游泳運動。這些進展表明，編程生命材料有望實現日益智能化的生命系統。展望未來，新型細胞-細胞信號可編程工具箱在多能細胞系中的應用有可能實現真正精細的全新類器官平臺，并具有定制的模式化和細胞命運決定功能。在這方面，Fussenegger 實驗室的開創性工作可作為未來的主要基礎，在細胞療法方面，從疾病反饋閉環到音樂和意念控制的基因調諧，先進的基因回路取得了眾多發展。

Fig. 4. Upscaling genetically programmed and patterned living cell assemblies. A) Material-to-cell synNotch-based programming of multicellular constructs. Top left: Schematics of receiver fibroblasts with   anti-mCherry/Gal4 synNotch that activates BFP and ETV2 when cultured on   substrates with mCherry, promoting endothelial differentiation; Vasculature-like pattern with resulting fluorescence microscopy images after three days. Top right: Schematics of dual-ligand microcontact printing and seeding of dual-receiver fibroblasts with anti-GFP/tTa synNotch, activating   miRFP and anti-mCherry/Gal4-VP64 synNotch that activates BFP; Fluorescence images of microcontact-printed perpendicular lines of GFP an mCherry and corresponding miRFP and BFP expression by dual-receiver cells, after one day. Bottom left: Schematics of anti-GFP/tTA synNotch receiver fibroblasts that   activate mCherry cultured on substrates microcontact-printed with GFP; mCherry fluorescence images of patterns, expressed by receiver cells cultured on GFP-patterned substrates, after two days. Bottom right: Schematics of microfluidic patterning platform with alternating rows of GFP and mCherry and corresponding microfluidic device, for promoting spatial co-differentiation of dual-lineage receiver cells into myogenic and endothelial lineages; Dual-lineage receiver fibroblasts with anti-GFP/tTA synNotch that activates MyoD and miRFP and orthogonal anti-mCherry/ Gal4-VP64 synNotch that activates ETV2 and BFP, cultured on corresponding substrates patterned with GFP and   mCherry; In the bottom, image of dual-lineage receiver cells cultured on the patterned substrates, after three days. Reproduced with permission. Copyright 2024, Springer Nature. B) Heat-inducible regulation of gene expression in artificial tissues. Top left: Schematics of HEAT (heat exchangers for   actuation of transcription) platform, in which a biocompatible fluid flows   around a power supplied heating element to preheat the fluid before entry in perfusable channel networks within hydrogel tissue constructs laden with heat-sensitive cells. During heating, the hydrogel temperature is continuously monitored using an infrared camera. Bottom left: Schematics of HEK293T cells engineered to express luciferase (fLuc) under HSPA6 promoter.  Right: Representative infrared and bioluminescence expression images of dynamic hydrogel activation in different days, showing different activated gene expression patterns through space and time. Reproduced with permission. Copyright 2020, American Association for the Advancement of Science (AAAS)

3.2為精準治療編碼更智能的活體生物植入物

為了在活體材料設計中充分應用基因工程工具，可以對細胞進行更智能化的編碼，以提高其治療潛力。隨著目前以細胞為基礎的療法取得廣泛成功，由哺乳動物細胞組成的基因編程活體組合可能會在下一代個性化干預方面取得前所未有的治療效果。值得注意的是，在過去的幾年中，已經建立了許多合成基因回路，以確保針對各種人類疾病（從癌癥到自身免疫或代謝紊亂）的細胞療法越來越強大。

受這些進展的啟發，早期的嘗試主要集中在基因升級細胞片、球體或支架支持的組合。例如，通過利用關鍵轉錄因子的過度表達，或在多細胞組合中敲入治療基因盒，實現了基因增強組織再生或傷口愈合干預。盡管如此，在生物相關組織結構中加入合成生物學啟發設計的細胞，有望加快治療性活系統的發展（圖 5）。Guilak 實驗室在預編程智能生物植入物方面取得了多項進展，這些植入物可自主響應生物線索，具有類似機器的動態行為。例如，利用軟骨組織中的機械感應通道 TRPV4，將水凝膠生物植入物與軟骨細胞結合在一起，形成機械回路。在生理機械負荷下，這種設計的構建體可以按需感知并自我調節 IL-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）的釋放，從而保護組織免受促炎癥條件的影響。在另一種方法中，CRISPR/Cas9 編輯的   iPSCs 被用于生物工程活軟骨組織，并在三維編織支架（圖 5A）和瓊脂糖棒狀軟骨植入物中組裝自我調節的抗細胞因子療法。從本質上講，通過感知炎癥性 IL-1，此類生物系統可以利用可誘導的巨噬細胞趨化蛋白-1（Ccl2）啟動子，以反饋方式對生理水平的 IL-1Ra 做出反應。

未來，這種閉環人工植入物可在不同的人類疾病條件下進行探索，以實現自主、穩健的細胞給藥平臺。此外，遠紅光控制的免疫調節設計細胞（FLICs）已被載入水凝膠，以實現對癌癥靶向免疫治療干預的遠程無痕控制（圖 5B）。在按需照射時，這種生物植入物可釋放 INF-β、TNF-β 和   IL-12 細胞因子，促進抗腫瘤術后復發的長期活性，最終延長動物的存活率。將復雜的電氣和軟件原理引入哺乳動物的生命系統，可以進一步增加關鍵層的復雜性和功能性。作為概念驗證，已開發出用于糖尿病治療的智能手機調控光遺傳水凝膠結構（圖 5C）。在這種平臺中，用戶控制的智能手機可以遠程激活水凝膠中的發光二極管，進而誘導光遺傳工程細胞釋放人胰高血糖素樣肽的短變體（shGLP-1）或胰島素。在同一系統中，還可進一步利用藍牙激活的血糖儀實時測量體內生理血糖水平，以無線閉環網絡的方式自動觸發技術級聯。

Fig. 5. Bioengineering smarter therapeutic mammalian living materials. A) Gene edited self-regulated anti-cytokine bioimplant for treatment of inflammatory diseases. Left: Schematics of CRISPR/Cas9-based iPSCs engineering with a synthetic gene circuit expressing IL-1Ra, in response to activation of the Ccl2 promoter. Cells were   loaded on 3D cartilaginous woven constructs in chondrogenic media. Topcenter: Gene edited cells on porous 3D woven scaffold (nano-computedtomography). Top right: Longevity of implanted constructs, demonstrated by   consistent luciferase expression, in mice. Bottom center: Implants reduced inflammation. Bottom right: Mice treated with Ccl2/IL-1Ra implants demonstrate reduced bone damage. Reproduced with permission. Copyright 2022, American Association for the Advancement of Science (AAAS). B) Optogenetic immunotherapeutic construct for cancer treatment. Left: Schematics of optogenetic perioperative immunotherapy mediated by far-red light-controlled immunomodulatory engineered cells (FLICs), encapsulated within a polysaccharide-based hydrogel. Top right: Mixture of far-red light-controlled immunomodulatory designer cells (FLICs) with hydrogel polysaccharide solution, promoting crosslinking of hydrogel matrix, through crosslinking by ions interactions from the cell   culture medium and solidified. Bottom right: In vivo bioluminescence imaging of tumor recurrence, being significantly reduced only under far-red   light (FRL) illumination, with an LED array (λ=730 nm, 1 mW/cm2 ). Reproduced with permission. Copyright 2022, Springer Nature. C) Smartphone-controlled optogenetic implant for treatment of diabetes. Left: Schematics of smartphone-optogenetically regulated electronic system. Smartphone-remote controlled field generator of HydrogelLED implants induce expression of insulin of shGLP-1. Signals of blood glucose are sent via bluetooth to electronic system for autonomously activating the therapeutic system. Right: LED intensity activating designer cells, as reported on the smartphone. Reproduced with permission. Copyright 2017, American Association for the Advancement of Science (AAAS).

總的來說，我們之前描述了基因工程哺乳動物活體材料和應用的一些主要例子，以及其制造中采用的由內而外的策略和細胞類型，并在下表1中進行了總結。

4. 展望及未來展望

設計具有基因編碼功能的哺乳動物活體材料的工作進展迅速，前景廣闊。這種由內而外的技術已經得到了明智的探索，使工程組織具有本地發現和用戶可控的活體特征（即血管化、圖案化、適應性、驅動等），從而全面提高了它們在疾病建模、組織工程和軟機器人等應用領域的探索能力。

基因組和表觀基因組編輯器正在快速發展，無疤痕大型轉基因插入的新興平臺，如TwinPE、PASTE、PASSIGE或STRAIGHT-IN，可以預見這些可以使越來越復雜的合成基因盒在哺乳動物細胞中的熟練整合。

此外，設計“底盤 ”細胞具有更復雜的可切換行為、新型合成受體和信號通路，可加速生成可定制的活體結構。電遺傳學可使研究人員設計出下一代生物電子活體界面，甚至具有電可調性的整個合成活體組織。更進一步說，CAR-T 細胞的進步也能啟發未來的設計，例如利用布爾電路組裝邏輯門控智能活體系統，或利用安全開關（如自殺或開/關操作）實現高度可控的細胞行為。我們預計，在這樣一個處于早期階段的領域，未來的進步將以由內而外戰略的不斷努力為標志。

展望未來，具有材料基因界面開關的結構材料對于在空間上調節細胞命運或嵌入材料的設計細胞的活動非常有意義。在這種情況下，我們設想未來與精密化學、微流體技術和生物制造相關的進步將成為推動細胞密集型活體材料發展的關鍵。例如，基因編輯的三維生物仿真片上器官技術可以簡化更具臨床價值的人源化同種疾病模型[7]。此外，在可預見的未來，設計細胞與含有生物傳感器的片上器官的結合有可能實現對生物數據的實時監測。

盡管前景廣闊，但鑒于這類系統的復雜性，可以預見許多挑戰。與工程組織和細胞產品目前在臨床轉化方面遇到的監管障礙類似，基因賦能的活體材料預計也會在基因遞送載體的效率、制造、可重復性、細胞源標準化和安全性方面遇到重大障礙。此外，由于合成生物學可能賦予研究人員編碼新穎/非天然特征的能力，倫理方面的影響也可能上升。iPSCs   衍生的治療組合可從特定基因編輯中獲得巨大收益，以減少潛在的免疫原性痕跡。此外，單細胞 CRISPR 篩選等技術也極具優勢，可在體外對有機體中的基因調控通路進行高通量分析。未來，一個潛在的挑戰可能是如何確保細胞在活體材料中長時間保持功能，這可能會阻礙細胞的最終應用。