1. 實驗概述

在分子生物學實驗中，細菌克隆形成單位（CFU）主要用于檢測三方面：

一是檢測細菌數量，以菌落數代表活菌數，用于評估食品等受細菌污染程度；

二是反映細菌活力，處理前后CFU數量變化可體現處理對細菌活力的影響；

三是探究細菌生長特性，借不同培養條件下CFU情況了解細菌對環境的適應性。

例如：CFU可反映免疫細胞例如巨噬細胞防御細菌的作用功能，體現細菌的存活率。在醫學研究應用廣泛。

疾病診斷上，能檢測痰液等樣本中的病原菌及數量，還可篩查耐藥菌，例如結核分枝桿菌。下面介紹了細菌克隆形成單位（CFU）的基本實驗步驟和注意事項。 

2. 實驗步驟

2.1 準備工作

（1）實驗器材和試劑：準備無菌的培養皿、移液器、吸頭、LB培養基（或其他適合細菌生長的培養基例如分枝桿菌培養的Middle Brook 7H10固體培養基）、恒溫培養箱（37℃）、0.1% TritonX-100裂解液、無菌PBS、抗生素（氨芐青霉素、兩性霉素B、羧芐青霉素）。

（2）將培養基高溫高壓滅菌，待冷卻至約50~60℃左右時（手可以直接接觸的溫度），在超凈工作臺中倒入培養皿，每個培養皿倒入約15~20 mL培養基，使其均勻鋪滿培養皿底部，待培養基凝固后備用。

2.2 以巨噬細胞吞噬分枝桿菌為例，具體實驗步驟如下：

（1）接種細胞：將1×106個/孔的巨噬細胞的鋪至6孔板，5%CO2，37℃的培養箱培養24~48 h。

（2）實驗干預：根據自己實驗要求用不同的藥物濃度干預細胞，然后以細胞數目的10倍的菌濃度（MOI=10）感染細胞。

感染復數（Multiplicity of Infection，MOI）：是指在感染時病毒或噬菌體與細胞或細菌數量的比值。例如MOI=10，即以細胞數目10倍的菌濃度感染目的細胞。

（3）細菌CFU測定：

感染處理：感染后4 h后用1×PBS洗滌細胞3次，并加入5%的青霉素-鏈霉素混合溶液殺死胞外菌；重新孵育6 h后更換不含青霉素-鏈霉素的培養基。細胞繼續孵育24 h后，用1×PBS洗滌細胞，用0.1% TritonX-100充分裂解細胞15 min，加入完全培養基或者PBS終止裂解；并將細胞收集至2 mL的離心管，200 rpm 振蕩10 min。

2000 rpm 3 min收集細胞沉淀，并用1 mL完全培養基重懸細胞，將收集的細胞裂解液連續稀釋成不同濃度菌懸液。

為使取液方便，稀釋前將菌母液移裝至5 mL EP管，取新的EP管9只，分別編號1、2、3、4、5、6、7、8、9，每只裝900 μL無菌PBS。用移液槍吸取菌母液100 μL菌液至EP管1制成1mL菌懸液，旋渦振蕩器混勻即為第一稀釋梯度菌懸液(10-1)；吸取100 μL試管1(10-1)梯度菌懸液至編號2的試管中，混合均勻，得到第二稀釋度的菌懸液(10-2)，以此類推，得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度菌懸液。

將上述步驟稀釋好的菌懸液取一定量（通常50~100 μL）依次涂布在目標培養基中，分枝桿菌需要放置37℃的培養箱培養3~4周左右。

定期觀察細菌生長狀態以及生長密度，選擇生長密度適中的菌懸液進行2次涂布。

CFU手動計數：在菌懸液生長密度正常的情況下，能夠清晰看到規定時間內菌生長的數目，因此可以通過肉眼直觀的進行菌的克隆單位計數；但密度過小或者過大均可能導致一定誤差（圖1）。人工手動計數，CFU以3份為單位計數。若細菌克隆數目越少，說明實驗干預能夠促進對細菌的殺傷；相反實驗干預促進細菌的存活。

計算：原菌液濃度(CFU/mL)=實際菌落數(CFU)/取樣體積(mL)*稀釋倍數。

3. 注意事項

（1）菌實驗操作過程均在超凈工作臺或者生物安全柜中進行，嚴格遵守無菌操作原則，防止雜菌污染。

（2）稀釋菌懸液時，要確保移液器的準確性，避免吸取液體體積不準確導致稀釋倍數錯誤。同時，每次稀釋后要充分混勻，使細菌均勻分布在稀釋液中。

（3）涂布前，應充分用酒精燈灼燒涂布棒，冷卻后將移液槍轉移的菌液涂抹均勻，以免高溫殺死細菌。

（4）涂布時充分涂勻菌懸液，注意力度均勻，避免劃破培養基表面，同時要確保菌液均勻涂布在整個平板上，避免出現局部菌液過多或過少的情況，涂布過程中可以不停地轉動培養基。

（5）估算菌落時，可以借助放大鏡或菌落計數器進行計數。同時，要對每個稀釋度的平板進行多次計數，取平均值提高計數的準確性。

（6）注意防護，注意穿實驗服、戴口罩和戴手套。