光學活性物質對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數（ε）是不相等的，εL≠εR，這會使左、右圓偏振光透過后變成橢圓偏振光，這種現象稱為圓二色性（Circular dichroism，縮寫為 CD）。根據圓二色光譜法的原理和測試要求設計制成的儀器稱為圓二色光譜儀，該儀器廣泛應用于蛋白質折疊、蛋白質構象、酶動力學、配位化合物、手性化合物等的科學研究。

利用圓二色光譜儀進行分析時，所得結果常以圓二色光譜顯示。圓二色光譜中的橫坐標是平面偏振光的波長 λ，縱坐標為吸收系數之差（Δε=εL-εR）。由于 εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，摩爾橢圓度 [θ] 與 Δε 的關系為：[θ]=3300Δε，因此圓二色光譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標，以波長為橫坐標作圖。

圓二色光譜儀的原理

光是橫電磁波，是一種在各個方向上振動的射線。其電場矢量與磁場矢量相互垂直，且與光波傳播方向垂直。由于產生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動面。若此振動面不隨時間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動面即稱為偏振面，如圖 1 所示。

圖 1 平面偏振光產生示意圖

平面偏振光可分解為振幅、頻率相同，旋轉方向相反的兩圓偏振光，如圖 2 所示，圓偏振光的振幅保持不變，而方向周期性變化，電場矢量繞傳播方向螺旋前進。

圖 2 兩圓偏振光示意圖

其中電矢量以順時針方向旋轉的稱為右旋圓偏振光，如圖 3 所示。其中以逆時針方向旋轉的稱為左旋圓偏振光，如圖 4 所示。兩束振幅、頻率相同，旋轉方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。如果兩束偏振光的振幅不相同，則合成的將是一束橢圓偏振光。

圖 3 右旋圓偏振光示意圖

圖 4 左旋圓偏振光示意圖

即能使射入物質的平面偏振光的偏振面旋轉的物質稱為旋光性物質或光學活性物質，具有手性結構的分子才具有光學活性。

圓二色光譜儀的結構

圓二色光譜儀主要由氙燈、單色器、光電調節器、樣品池以及光電倍增管檢測器組成，其結構簡示圖如圖 5 所示。

圖 5 圓二色光譜儀的原理圖

該儀器采用氙燈作光源，光電倍增管作檢測器，波長范圍 165~850nm，檢測范圍為 ±3000m°，具有波長可調、光通量大、靈敏度高、數據準確和信噪比高等優勢。其中旋光色散附件包含一個可旋轉的線偏振分析棱鏡，其以 45° 角處在樣品和檢測器之間來切換垂直和水平光。在圓二色光譜儀的光路上裝配旋光色散附件即可進行旋光的測定，從而在手性藥物研究中不需使用兩種儀器。

圓二色光譜儀的圖譜

我們在引言部分提到了圓二色光譜儀的圖譜，即圓二色譜。由于吸收系數之差（Δε）有正值和負值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負性圓二色譜。在紫外可見光區域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機化合物的構型和構象。

如圖 6 所示的圓二色譜，其中包含的三種曲線所代表的含義如下所示：

當光學活性化合物對光沒有特征吸收時，在譜圖中僅為一條近似水平的直線；當光學活性化合物對光存在特征吸收時，通常有兩種情況：（1）當 εL＞εR 時，得到一個正性的圓二色光譜曲線；（2）當 εL＜εR 時，得到一個負性的圓二色光譜曲線。

圖 6 圓二色光譜圖曲線

獲取理想的圖譜

在用圓二色光譜儀對溶液或固體樣品進行測試時，我們都想獲取理想的 CD 譜圖，為了實現這個目的，我們應該注意以下幾個方面：

手性樣品符合 CD 光譜測試的條件（在給定波長范圍內有較強的CD信號和合適的吸收值）。必須事先測定手性樣品的 UV-Vis 吸收光譜（溶液或固體漫反射），預測 CD 譜峰的可能位置和選擇合適的制樣濃度（對于溶液吸收光譜，A≈1）。

提供高對映純度的手性樣品。

根據樣品的性質選擇測定方式（溶液、固體、單晶或熒光 CD）。

對溶液樣品應選用合適的溶劑、濃度和光程（與測定 UV-Vis 光譜類似）。對于在紫外區測試的樣品建議選用較小的光程（≤0.5cm）和截止波長足夠低的溶劑，最好為高純水或醇類溶劑。

對固體樣品的壓片法測試，應視樣品的不同選用合適百分比濃度及合適的稀釋劑（KBr、KCl 或 CsI 等）研磨壓片后進行透射掃描。

選擇適當的測定參數（波長范圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等）。

對于同一個樣品，在可能的條件下，建議同時做其溶液和固體 CD 光譜加以比較。

最好同時做一對對映體的 CD 光譜，以檢查其 CD 信號的真偽和在定量的條件下互相印證其對映純度。

圓二色光譜儀的主要優勢

圓二色光譜儀的主要技術性能優勢如下：

1.光通量大，特別的光學設計，大大地提高了光通量、光強度，能在全波長范圍都可得到很好的信噪比，保證檢測數據的真實性。

2.靈敏度高，可以檢測更細微的結構信息，如帶寬可以小至 0.1nm、0.01nm，從而能在檢測時得到精確、細微的指紋性結構信息。

3.樣品（如有機合成物、蛋白樣品等）的用量少，可以用很微小的樣品池，如光程為 0.01mm（2.6μL）、0.1mm（26μL）的樣品池。

4.檢測器的位置可以調節，在分析脂質體等高光散射類樣品時，得到特別大的光通量。

5.直接分析溫度相關的 CD 光譜信息，從而得到熱力學分析信息。

圓二色光譜儀的主要應用

由于生物大分子基本都含有手性的基團和結構，而圓二色光譜儀可以幫助測量和觀察生物大分子的結構和構象變化，因此圓二色光譜技術成為生物物理和生物化學研究中的一個非常重要的手段，被廣泛應用于有機化學，生物化學，配位化學和藥物化學等領域，其主要應用如下。

手性結構測定：如官能團的位置及特定原子在手性分子中的位置的測定。

構型的測定：利用對應關系和鄰近關系測定密切相關的一類化合物的相對構型；利用八區律等一類經驗和半經驗的規律，結合其它方法測定絕對構型。

手性介質（包括溶劑和手性大分子）誘導的光學活性的研究，即一個非手性分子被外部介質所誘導而產生光學活性。

溶劑效應：研究溶劑與溶質間的相互作用及該作用對分子的光學活性的影響。

圓二色光譜儀還可以用作光譜分析。

在分子生物學領域中，蛋白質溶液的圓二色譜可以反映蛋白質的立體結構信息。蛋白質是氨基酸以肽鍵聯接而成的具有特定空間結構的生物大分子，其圓二色性表現為生色基團和折疊結構的總和。

張強等人在《中華鱉裙邊膠原蛋白的提取、鑒定及其理化性質》一文中利用 Chirascan V100 型圓二色光譜儀對膠原蛋白的微觀結構進行分析，實驗中將凍干樣品溶于 0.05mol/L 的乙酸中，配制成 0.3mg/mL 的膠原蛋白溶液，取少量溶液加入 2mm 比色皿中，放入圓二色光譜儀中，于 25℃，190~250nm 的波長下掃描三次，記錄各光譜曲線，結果如圖 7 所示。

圖 7 裙邊酸溶性膠原 ASC 和酶浴性膠原 PSC 在 25℃ 時的圓二色光譜

由圖中可以看出，在 25 ℃ 下 ASC 和 PSC 的特征圓二色光譜分別在 224nm 和 222nm 處出現正峰，這是左旋聚脯氨酸構型的圓二色譜典型特征，根據結果分析，PSC 的正/負吸收峰比值較 ASC 大，則說明 PSC 比 ASC 的三重螺旋結構更完整。

圓二色光譜也常用于研究手性金納米粒子的微觀結構和手性來源，韋克毅等人將手性金納米粒子的 CD 光譜信號的變化與 Ag+ 的濃度相關聯，這種方法既拓展了金納米粒子的應用范圍，又對 Ag+ 的識別與檢測提供了新的方法。

圖 8 和圖 9 分別為手性金納米粒子溶液中加入 10μmol/L Ag+ 后，在 0，0.5，1.0，3.0，4.0，6.0，7.5，10，11，14，15，20 和 25min 時的 CD 光譜以及在 230nm 處 CD 光譜強度的猝滅圖。

圖 8 手性金納米粒子溶液加入 Ag+ 后 CD 光譜圖

從圖中可以看出，手性金納米粒子的 CD 光譜強度隨著 Ag+ 的加入迅速下降，最終趨于穩定，穩定時間為 12min，從響應時間的角度考慮，該方法可以應用于 Ag+ 的快速識別與檢測 。

圖 9 CD 光譜強度猝滅圖

從上述的兩個實例中不難看出，圓二色光譜儀對于研究分子結構不對稱性、手性結構測定等具有重要作用，在人們的生產生活中扮演著極其重要的角色。