1. 概述

阿利新藍，也叫愛茜藍、阿爾新藍等，英文原名Alcian blue，是一種陽離子染料，對酸性粘液物質具有很強的特異性，是對酸性粘多糖進行染色時最具特異性的染料。染料分子與酸性基團形成鹽鍵，利用染料的不同pH及不同電解質濃度，可區分酸性多糖物質的類別。

在這里介紹這一冷門染色劑是因為，大家在實驗室中最常用的電泳技術SDS-PAGE在跑完以后通常都要對蛋白進行染色以可視化。

眾所周知，蛋白質廣泛具有轉錄后修飾，糖基化是其中一種，而糖蛋白在生物組織中廣泛存在，對信號轉導具有重要意義。而這一轉錄后修飾在做WB實驗時經常會影響條帶的預期位置與分子量等重要信息。

常用的蛋白質染色法考馬斯亮藍和銀染對糖蛋白檢測效果并不好，高度糖基化的糖蛋白由于糖鏈干擾銀離子結合，會導致染色效果弱，靈敏度低，甚至無法檢測。這也是各位同學在WB實驗中遇到各種玄學的原因之一。

雖然有傳統的PAS染色法，采用Schiff堿反應檢測糖蛋白，其靈敏度也不夠高。因此，對具有糖基化修飾的蛋白進行改良的特異性染色很有必要。

在此介紹PAS-AB染色法的進一步改良，即過碘酸Schiff-阿利新藍聯用，并輔以銀染增強染色效果。

圖源：AB-PAS染色-四川賽因斯特生物科技有限公司

2. 染色原理

使用高碘酸氧化糖蛋白，以避免阿利新藍單染糖蛋白顯色微弱；

使用阿利新藍與氧化的糖蛋白結合以顯示糖蛋白；

由于阿利新藍對非糖基化蛋白的銀染沒有負面影響，使用銀染對非糖基化蛋白進行染色，如此操作后，糖基化和非糖基化的蛋白質均被染色。

染色優勢：

可以檢測SDS凝膠中納克濃度的高度糖基化蛋白，適用于濃度很低的混合樣品及少量純樣品中的糖蛋白檢測。

3. 實驗材料

固定液：10%(v/v)三氯醋酸水溶液

洗滌液：Ⅰ，25%(v/v)甲醇，10%(v/v)醋酸；Ⅱ，10%(v/v)甲醇，5%(v/v)醋酸；Ⅲ，5%(v/v)醋酸

氧化液：1%(w/v)高碘酸

還原液：0.5%(w/v)焦亞硫酸鉀

染色液：0.125%(w/v)愛茜藍溶于洗滌液Ⅰ，使用前需過濾

光敏處理液：5%(v/v)戊二醛，現用現配

顯影儲液：2.5%(w/v)碳酸鈉

銀液：0.4%(w/v)硝酸銀，現用現配

顯影液：向顯影儲液中加入甲醛至終濃度為0.013%(v/v)，現用現配

終止液：10%(v/v)的醋酸、10%(v/v)甘油

4. 染色步驟

電泳結束后，將凝膠轉移到帶蓋培養皿中，加入固定液，于30℃固定10 min。

用洗滌液Ⅲ洗滌凝膠2次，每次2min。然后將凝膠浸沒在氧化液中，于30℃氧化20min，再用洗滌液Ⅲ洗滌凝膠2次，每次2min，再用水洗滌2次，每次2min；加入還原液于30℃還原12min，用水洗滌凝膠2次，每次2min，然后在50℃用洗滌液Ⅰ洗滌凝膠2次，每次2min。

加入染色液，于50 ℃染色 15 min。

用洗滌液Ⅰ洗滌凝膠3次，時間分別為1、4、5min，然后用洗滌液在59℃洗滌2次，時間分別為2、4min。阿爾新藍在隨后的銀染過程中將被不可逆地固定在凝膠中，形成墨綠色的背景，需用稀醋酸沖洗至背景僅保留微弱的藍色。

加入光敏處理液，于50 ℃處理6 min。

用洗滌液Ⅱ洗滌凝膠2次，時間分別為3、5min，隨后在50 ℃用水洗滌2次，每次2 min。

將凝膠浸沒在銀染色液中，于40℃染色6.5 min。

于30℃用水洗滌凝膠2次，每次30s。

用新鮮配制的顯影液于室溫下顯影30s，產生黑色的沉淀，將凝膠轉移到新鮮的顯影液中，再顯影4~8min，具體的顯影時長需根據所要求的靈敏度和背景染色情況以及特異性調整。通常1~3min后可看到糖蛋白，非糖基化蛋白在4~8 min后顯影，按順序對凝膠進行拍照留檔。

加入終止液保持5 min，終止顯影。

5. 參考文獻

[1] 張建社，褚武英，陳韜，2009，蛋白質分離與純化技術，軍事醫學科學出版社