［摘要］ 近年來基因編輯生物技術藥物展現出巨大的臨床治療潛力，隨著表觀遺傳編輯、線粒體基因編輯等先進技術的不斷發展，基因編輯器序列和結構也在快速迭代。但該領域現階段仍面臨精準度不足、編輯效率波動大、脫靶效應顯著等問題，制約了基因編輯治療藥品臨床的廣泛應用。基因編輯治療藥品藥學研究中，基因編輯器序列設計和結構、純度等質量屬性的差異直接影響該類藥品的編輯準確性和編輯精度，進而影響藥品的安全性和有效性。基因編輯藥品研發和監管領域需要探索合理的多維度質量評估策略，建立科學高效的藥品監管工具。本文調研了體內基因編輯治療藥品和體外基因編輯細胞藥品的研究進展和申報現狀，圍繞基因編輯酶和sgRNA結構、純度、體外基因編輯效率、體外編輯特異性等提出基因編輯器藥學設計和質量評價的考慮，為該類藥品的研發和質量評價提供參考。

 

1.前言

 

基因編輯（genome editing）指在體內或體外采用核酸酶等工具實現序列添加、刪除、改變、更換等方式改變人基因組特定位置DNA 序列的過程。近年來，新型基因編輯、堿基編輯、先導編輯、表觀基因組編輯和線粒體基因編輯等技術手段的發展日新月異，占據了生物醫藥產業創新戰略高地，創新研發生態日益成熟[1] 。目前全球在研的基因編輯類藥品包括體內基因編輯藥品（in vivogenome modification)和體外基因修飾細胞(ex vivogenome modification）和體外基因修飾細胞（ex vivogenome modification）兩類基因編輯藥品。由CRISPR/Vertex 公司聯合研發的CRISPR/Cas9 體外基因編輯造血干細胞Casgevy(exagamglogene autotemcel, Exa-cel)已于2023 年11和12 月先后被英國藥品和健康產品管理局（MHRA）、美國FDA授予有條件上市許可[2] 。全球首款進入臨床試驗的基因編輯治療產品NTLA-2001由Intellia制藥公司研發，是現階段進展最快的體內CRISPR基因編輯療法。我國基因修飾治療藥品的研發和注冊申報數量也在逐年增加，截至2024 年12 月，約有10 余個基因編輯治療產品獲得國家藥品監督管理局（NMPA）藥品審評中心默示許可進入臨床試驗（見表1）。

 

 

 

不同基因編輯工具（基因編輯酶、向導RNA等）和其遞送系統的組合衍生出多種復雜的基因編輯類藥品，其結構設計和質量方面的差異可直接影響到體內基因編輯藥品/體外基因修飾細胞的安全性和有效性。現有的基因編輯技術雖已展現出巨大的潛力，但仍面臨精準度不足、編輯效率波動大、脫靶效應顯著等問題[3] 。產生雙鏈DNA 斷裂的基因編輯技術可能產生染色體斷裂相關的基因組不穩定的風險，對于兒科患者和育齡患者的體內基因編輯需要充分評估對下一代的影響。不同類型基因編輯工具臨床應用過程中，脫靶編輯、非預期在靶編輯和染色體重組等發生的程度也各有差異[4] 。為確保基因編輯的安全、精準和高效，需要研究明確基因編輯藥品的生產用原材料、工藝和質量研究的監管考慮，推動質量可控、安全有效的基因編輯藥物快速審批上市。本文將介紹該類產品的藥學評價（ＣＭＣ）研究現狀和審評考慮，給研發人員提供參考。

 

2.基因編輯治療藥物CMC研究現狀

 

2.1　基因編輯治療藥品CMC研究挑戰

 

對于使用了基因編輯器的細胞基因治療產品，現階段需要采用多種方法對CRISPR-Cas, CBE/ABE堿基編輯酶等編輯系統進行全面的風險分析和評估。例如：編輯系統自身特定的局限性、序列靶向的特異性、脫靶位點的分析、編輯酶的保真性（fidelity）和編輯效率、編輯系統的生產和質量控制、編輯技術對細胞促瘤/成瘤的優勢篩選、編輯系統組分的免疫原性、編輯工具相關序列的非特異性插入、多靶點編輯的基因組重排等[5] 。基因編輯工具的編輯準確性（編輯位點的特異性）和編輯精度（即產生確切的所需編輯結果）是目前基因編輯類藥品研發和審評領域的關鍵挑戰[6] 。質量研究方面需要結合科學研究進展和方法學的改進，完善基因編輯系統的質控策略。

 

基因編輯器的序列篩選和結構設計方面，為了降低基因編輯酶發生非預期基因組切割的概率，常見的策略包括通過生物信息學預測模型篩選基因編輯酶序列、結合結構生物學合理優化酶結構以減少非酶依賴的核酸結合、使用新的基因遞送方法將基因編輯工具靶向遞送到目標位點等[7] 。因此需要結合目標產品的體內外研究數據以及現有生物信息學預測工具，對基因編輯器的準確性、編輯精度進行評價和確認，確認篩選和優化過程的合理性和安全性。

 

基因編輯藥物質量研究方面，考慮到DNA、RNA、蛋白質等不同基因編輯工具的物質基礎各不相同，也需要相應對基因編輯工具的結構（宏觀/微觀）、純度、生物學活性進行研究，探索各質量屬性和臨床安全性、有效性的關聯，確認關鍵質量屬性的判定依據和標準限度。

 

然而，基因編輯工具篩選和特異性分析、深度測序等產生大量生物信息學數據，該類數據評價時往往需要借助生物信息學分析工具，并可能需要模擬數據（in silico data）進行方法學驗證[8] ；基因編輯工具的質量研究方面，復雜修飾sgRNA的質量分析方法仍在不斷探索優化中，序列確認、純度、序列變異體、二級結構和堿基修飾分析等方法學驗證均存在較多難點[9] ；基因編輯細胞終產品的表征中，患者個體基因組和細胞質量等方面的差異可能導致基因編輯效率和編輯精度產生較大差異。綜上，基因編輯器序列、結構的多樣性和質量變異性需要多維度進行質量評價，為該類藥品的科學監管帶來了巨大的挑戰。

 

2.2　基因編輯治療藥品CMC技術指南

 

目前，包括美國FDA、歐洲EMA、日本PMDA 在內的發達國家監管機構均發布了基因編輯藥物相關技術指南，提出了基因編輯類產品前沿技術評價考慮[10-11] 。國內外各監管機構發布的指南中含有部分基因修飾系統的藥學技術要求，說明需要評估基因編輯產品分子設計、工藝研究、質量研究與質量控制評價方法及標準等[12-13] ，但未針對不同類型基因修飾系統明確技術要求。

 

研究和評價方面，基因編輯工具篩選相關數據庫、預測算法及分析流程、深度測序分析方法及驗證等先進工具系統化和標準化的評價方法全球缺乏一定的共識。美國FDA結合自有的基因編輯藥物質量和安全性數據庫以及產品審評經驗積累，對于該類基因編輯器的純度、編輯精度等部分質量控制項目提出了具體研究方法和標準[14] 。在2022 年12月召開的學術討論會中，美國FDA提出了需要借助機器學習等先進的工具開展基因編輯產品精準性評價方面的監管研究，并強調建立sgRNA數據庫等用于審評標準研究的重要性[15] 。我國也在2022 年發布的《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》等指南中提出了初步考慮，但尚未針對基因編輯工具和藥品發布相關系統性的指南[16] 。在基因編輯酶序列、結構合理設計和關鍵質量屬性評價方面，需要將準確的基因編輯科學知識與藥品評價相結合，建立能夠準確反映基因編輯工具質量和安全有效性的基因編輯藥品評價技術要求。

 

3. CRISPR-Cas類基因編輯治療藥品質量評價考慮

 

3.1　序列設計與上游構建

 

優化基因編輯器的結構是降低脫靶效應的主要途徑。目前，有多種優化方法可提高編輯效率，降低脫靶效應和基因組重排，包括sgRNA序列優化、編輯酶結構優化等。近年來，多種人工智能工具逐漸應用于基因編輯器效果預測和優化，通過添加基因編輯領域專業知識和外部工具，進行CRISPR基因編輯、表觀遺傳編輯、先導編輯和堿基編輯工具的編輯效率和脫靶效果的預測分析[17-19] 。盡管這類人工智能模型具有龐大的數據庫，但其缺乏精確的基因編輯藥物先驗知識和試驗細節（如sgRNA純度、用量等），容易產生不準確的響應。應用生物信息學預測軟件篩選的基因編輯器，其藥學質量評價也需要結合體內、體外研究確認篩選序列的合理性。

 

由于序列設計規則和算法不同，不同序列設計軟件或平臺推薦的sgRNA 等候選靶向結合序列可能會有較大的差異，評價時需要綜合對比多個平臺的設計和潛在脫靶位點的分析篩選候選序列。sgRNA通常由100 個核糖核苷酸組成，主要包含5'端的spacer序列以及3' 端的骨架序列。建議分析sgRNA序列的ｌｏｏｐ 結構、高級結構、上下文堿基、堿基修飾等特征，通過計算機分析確認sgRNA結合的DNA 序列除靶基因外，人體其他基因組區域沒有同源的DNA 序列，結合體外試驗研究脫靶位點，了解脫靶發生的頻率和影響。鼓勵研究探索序列設計與基因編輯效率、脫靶分析、生物學活性等的相關性，不斷優化基因編輯工具分子設計。

 

3.2　基因編輯工具的質量研究

 

基因編輯工具相關的質量研究項目包括序列、結構、純度、體外基因編輯效率、體外基因編輯特異性、生物學活性、一般理化特性和遞送系統相關質量研究等。該類產品的質量研究需要選擇先進且靈敏度滿足分析需求的方法，由于分析方法本身可能存在的局限性，可考慮同時采用原理互補的不同方法進行研究。通過全面的質量研究確認產品的關鍵質量屬性（critical quality attributes, CQA）。體內基因藥品生產涉及的基因編輯酶和sgRNA 可能通過脂質納米粒包裹、腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）載體遞送等方式用于人體給藥，其質量要求相比于體外基因編輯細胞使用的基因編輯工具更為嚴格。本文此處圍繞體內基因治療Cas9 蛋白和sgRNA序列的質量研究進行介紹。

 

3.2.1 Cas9 基因編輯酶質量研究和評價策略

 

重組表達Cas9蛋白的質量研究可參考重組蛋白類生物制品的藥學評價技術指南。對于編碼Cas9蛋白的mRNA，藥學研究可參考核酸類體內基因治療產品的要求。考慮到Cas9蛋白序列可能影響基因編輯藥品的基因編輯效率和脫靶效率，建議關注mRNA 序列的準確性和完整性。對于生物學活性，由于Cas9基因編輯酶需要結合sgRNA才可定位至靶基因區域發揮基因切割活性，結合產品作用機制，可以和sgRNA一并考察。另外，由于該類產品需要在體內發揮作用，需要關注mRNA 的穩定性是否可以支持體內基因編輯。

 

3.2.2 sgRNA 質量研究和評價策略

 

sgRNA的spacer序列由5' 端的20個核苷酸組成，它可通過堿基互補配對的方式識別靶向序列，并將Cas9-sgRNA復合物招募至需要編輯的位點；3' 端骨架序列主要通過參與Cas9蛋白的結合并引起后者的構象改變從而介導其內切酶活性，實現靶位點雙鏈切割。sgRNA結構確證檢測項目通常包括分子量檢測、序列分析（如二代測序）、堿基修飾鑒定、純度雜質分析等。

 

序列分析：sgRNA序列的合成工藝較為復雜，4 種單體堿基的縮合效率差異等原因可導致不同序列的sgRNA合成質量具有差異性。如使用二代測序方法， 考慮到該方法一般通過連接建庫構建sgRNA文庫，通過二代測序平臺檢測整個RNA 分子的序列正確性，因此在序列正確性分析方法學研究過程中，需要關注樣品前處理操作的合理性、序列擴增均勻性、測序文庫的質量、測序的準確性和重復性，相應建立二代測序方法和結果評價策略。

 

純度和雜質：sgRNA的純度對該類產品基因編輯的精度和準確度具有較大影響[20] ，進而影響該類產品的有效性和安全性。sgRNA相關雜質包括不同長度（超長序列、截短序列）、不同修飾類型（硫代磷酸立體化學異構體、脫硫序列、脫堿基序列）、支鏈雜質等，這些雜質可能增加產品的脫靶風險，可考慮采用ＬＣ?ＭＳ、毛細管電泳、離子層析或反向色譜等不同原理的方法開展產品相關雜質的研究[21] 。

 

為了提高sgRNA在體內的穩定性以及介導的基因編輯的效率并同時降低脫靶的頻率，現階段常見sgRNA序列中引入了不同的修飾位點，主要包括核苷酸的2'?Ｏ?甲基修飾以及核苷酸硫代修飾等。sgRNA的堿基修飾顯著影響CRISPR基因編輯系統的準確性和特異性。據報道，采用N6-methyladenosine, 5-methylcytidine和pseudouridine修飾可顯著提升sgRNA 與靶序列的配對緊密性，提升Cas9酶對目標DNA 效率的切割效率和基因編輯效率，同時降低sgRNA的免疫刺激和細胞毒性，建議研究時進一步設計相應的實驗驗證[20] 。

 

3.3　基因編輯細胞的質量研究

 

在常見細胞治療藥品的質量研究內容基礎上，基因編輯細胞特有的質量研究項目包括體外基因編輯效率、基因修飾細胞數量、體外基因編輯特異性和染色體重排分析等。當使用病毒載體、脂質納米粒等工具將基因組編輯工具引入細胞時，需要從基因轉導工具的感染性和細胞趨向性的角度分析目的細胞和非目的細胞基因修飾的程度和頻率，還應考慮到基因組編輯酶的持續表達增加脫靶效應的可能性。由于病毒載體介導的基因組編輯會導致基因組編輯酶的長期持續表達，建議評估基因組編輯酶的持續表達可能產生的后果。根據現階段基因編輯細胞藥物的研究現狀，基因編輯細胞的研究通常包括體外基因編輯效率、體外基因編輯特異性、體外成瘤性、生物學活性等藥學專業相關內容，也包括脫靶分析、體內藥效研究等非臨床研究關注的內容。基于基因編輯細胞藥物的藥學審評經驗和相關數據，本文重點介紹體外基因編輯效率、體外編輯特異性的藥學審評考慮和多靶點基因編輯質量評價的特殊考慮。

 

3.3.1　體外基因編輯效率研究

 

基因編輯效率檢測包括采用編輯后細胞樣品進行測序（一代測序或二代測序），或基于PCR擴增和測序的方法進行基因編輯效率評價。該方法涉及靶向基因組序列的PCR擴增、一代測序分析、二代測序及生物信息學分析、基因編輯效率計算方式的評價。考慮到該分析方法使用生物信息學方法，需要關注基因編輯效率檢測方法的基線噪聲、測序深度、測序深度變異系數、檢出Indel類型數、生物信息學軟件參數的合理性。該方法評價難點在于，CRISPR-Cas基因編輯細胞中基因編輯結果呈現出序列的多樣性，需要關注檢測結果的準確性和基因編輯效率計算方法的合理性。例如：考慮到細胞基因組序列的多樣性，需開展基因編輯效率檢測方法在多種序列混合樣品中檢測結果的準確性驗證研究，合理擬定質量標準限度。

 

3.3.2　體外基因編輯位點特異性研究　

 

當前較多產品采用GUIDE-SEQ,CIRCLE-SEQ和WGS進行編輯特異性預測（分析人基因組中與靶向位點序列高度相似的序列）和特定位點擴增測序檢測，評估基因編輯工具的編輯特異性。在編輯位點特異性評價方面需要篩選出潛在脫靶突變位點上下游20 bp內帶有5'-NGG-3' PAM的序列，考慮基因非特異編輯主要由于sgRNA與dsDNA靶點序列之間存在數目不定的錯配，來假設sgRNA-dsDNA之間同時存在的堿基錯配個數（mismatch），進而過濾序列。在方法的評價過程中需要關注堿基錯配個數設置的合理性、建庫流程、擴增子測序深度和本底變異水平、假陽性脫靶位點、生物信息方法學等方面的研究和驗證。

 

生物信息學預測的方法通過在人類全基因組數據范圍內比對和鑒定與sgRNA靶位點相似的DNA序列，進而預測潛在的錯配位點，然后再通過擴增子深度測序確認預測的脫靶位點是否真實存在。需要關注檢出的錯配是樣品本身遺傳背景導致，還是基因編輯工具特異性不足導致[22] 。目前公開的基因組數據庫中，亞洲人群的基因組數據相對較少。基于白人的數據庫檢測出的錯配可能與我國患者的實際情況存在差異，需要探索分析不同人種和不同來源的比對基因組對基因編輯位點特異性評價的影響，確定適用于中國人群的比對基因組的來源。對于遺傳多樣性高的人群，如具有非洲血統的人群中拷貝數變異和重復區域更難評估，需要獲得更多基因組序列信息進行更充分的遺傳多樣性分析[23-24] 。

 

3.3.3　多靶點基因編輯質量評價的特殊考慮　

 

在多靶點基因編輯過程中，考慮到基因組中2 個及以上“雙鏈DNA 斷裂”的形成可能產生染色體易位風險。審評建議針對性開展分析研究，例如：易位風險一般可采用引物延伸介導測序（Primer extension mediated sequencing, PEM-seq），長距離PCR(long range PCR)等方法分析評估，對于染色體畸變可考慮采用Ｇ 帶分析、多色熒光原位雜交（mFISH）、比較基因組雜交（CGH）等進行分析。但是這些分析方法也存在較多限制，例如：Ｇ 帶分析很難同時處理多個細胞并檢測到極少數具有染色體畸變的細胞。在發生“同源重組修復”（HDR）的基因編輯細胞中也報道了p53基因發生突變的情況，并且在敲除p53基因的細胞中HDR 效率增加，對于該類情況質量研究中審評也建議考慮關注p53基因突變細胞等相關特征的檢測[25]。

 

4.結語

 

近年來基因編輯技術發展迅速，藥物開發領域的應用也逐漸增多，多個臨床試驗藥物在腫瘤、血液病、神經肌肉等多種適應證中獲得了臨床數據證據。隨著技術的進步，研發者開始探索研發如多靶點基因編輯、不同基因編輯工具的組合使用等更為復雜的基因編輯藥品。該類產品的作用原理復雜、原材料種類多樣、生產工藝和質量研究的藥學評價存在較大難度。質量評價過程中也需要結合臨床適應證和產品特點進行風險評估，并需要積累生物信息學等前沿技術領域的科學認知，結合藥理毒理和臨床多專業考慮設定合理的評價策略。監管科學研究也可嘗試通過使用人工智能工具，結合藥品審評數據積累，形成基因編輯產品質量評價標準，通過發布相關標準或技術共識文件，高效協同提高相關產業創新發展能力和競爭力。期望通過監管機構、學術界和工業界的合作，加強與國際同行的溝通交流，促進我國基因編輯行業健康有序發展，同步提升我國先進治療藥品的監管水平。

 

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［１３］　ＴＡＶＲＩＤＯＵ Ａ， ＲＯＧＥＲＳ Ｄ， ＦＡＲＩＮＥＬＬＩ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ?ｅｄ?ｉｔｉｎｇ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ： ｔｈｅ ＥＭＡ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ［ Ｊ］． Ｎａｔ ＲｅｖＤｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ， ２０２４， ２３（４）： ２４２ －２４３．

 

［１４］　ＦＤＡ ＣＢＥＲ． Ｗｅｂｉｎａｒ： Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａ?ｔｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ［ＥＢ／ ＯＬ］． （２０２４ － ０２ － ２９）． ｈｔ?ｔｐｓ：／ ／ ｗｗｗ． ｆｄａ． ｇｏｖ／ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ ｓｅａｒｃｈ?ｆｄａ?ｇｕｉｄａｎｃｅ?ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ ｈｕｍａｎ?ｇｅｎｅ?ｔｈｅｒａｐｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ?ｈｕｍａｎ?ｇｅ?ｎｏｍｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ．

 

［１５］　ＦＤＡ． ＣＢＥＲ Ｗｅｂｉｎａｒ： ｗｏｒｋｓｈｏｐ： Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ?ｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｏｆｆ?Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ ＴｈｅｒａｐｙＰｒｏｄｕｃｔｓ［ ＥＢ／ ＯＬ］． （２０２２）． ｈｔｔｐｓ：／ ／ ｗｗｗ． ｆｄａ． ｇｏｖ／ ｖａｃｃｉｎｅｓ?ｂｌｏｏｄ?ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／ ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ?ｍｅｅｔｉｎｇｓ?ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ?ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／ ａｓｓｅｓ?ｓｉｎｇ?ｇｅｎｅｔｉｃ?ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ?ｃｏｎｔｅｘｔ?ｇｅｎｏｍｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｔａｒｇｅｔｓ?ｇｅｎｅ?ｔｈｅｒａｐｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?１２１６２０２２．

 

［１６］　國家藥品監督管理局藥品審評中心． 國家藥監局藥審中心關于發布《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》的通告（２０２２ 年第２９ 號） ［ＥＢ／ ＯＬ］． （２０２２）． ｈｔ?ｔｐ：／ ／ ａｓｓｉｓｔ１． ｃｄｅａｐｐ． ｏｒｇ． ｃｎ／ ｏｆｆｉｃｅ／ ｏｆｆｉｃｅＷｏｒｋＮｅｗｓ／ ｓｈｏｗ？ ｃｏｄｅ?Ｗｉｄ ＝７ｄ７４７ｂｃａａ５９６４３２ｂａ７９５２ｅ０７ｄ１４７ｅ１ｆｂ＆ｗｔｙｐｅ ＝２．

 

［１７］　ＤＩＸＩＴ Ｓ， ＫＵＭＡＲ Ａ， ＳＲＩＮＩＶＡＳＡＮ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｇｅ?ｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ： ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ， ｃｈａｌｌｅｎ?ｇｅｓ， ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０２４，１１： １３３５９０１．

 

［１８］　ＡＲＢＡＢ Ｍ， ＳＨＥＮ ＭＷ， ＭＯＫ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｔａｒｇｅｔ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ， ２０２０， １８２（２）： ４６３ －４８０， ｅ３０．

 

［１９］　ＭＡＴＨＩＳ Ｎ， ＡＬＬＡＭ Ａ， ＫＩＳＳＬＩＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｉｍｅｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ ｂｙ ｄｅｅｐ ｌｅａｒｎｉｎｇ［Ｊ］． ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０２３， ４１（８）： １１５１ －１１５９．

 

［２０］　ＰＲＯＫＨＯＲＯＶＡ ＤＶ， ＶＯＫＨＴＡＮＴＳＥＶ ＩＰ， ＴＯＬＳＴＯＶＡ ＰＯ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｃａｎ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ?Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［ Ｊ］． ＣＲＩＳＰＲ Ｊ，２０２２， ５（６）： ７９９ －８１２．

 

［２１］　ＢＥＣＥＴＴＥ ＯＢ， ＴＲＡＮ Ａ， ＭＡＲＩＮＯ ＪＰ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ?ｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｌｉｔｈｉｕｍ ａｄｄｕｃｔ ｃｏｎ?ｓｏｌｉｄａｔｅｄ ＭＡＬＤＩ?ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ?ｔｒｏｍ， ２０２２， ４８１： １１６９１３．

 

［２２］　ＳＣＯＴＴ ＤＡ， ＺＨＡＮＧ Ｆ． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎ ＣＲＩＳＰＲ?ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ［ Ｊ］． Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１７， ２３（９）： １０９５ －１１０１．

 

［２３］　ＣＡＮＣＥＬＬＩＥＲＩ Ｓ， ＺＥＮＧ Ｊ， ＬＩＮ ＬＹ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉ?ｖｅｒｓｉｔｙ ａｌｔｅｒｓ ｏｆｆ?ｔａｒｇｅｔ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２０２３， ５５（１）： ３４ －４３．

 

［２４］　ＣＡＮＶＥＲ ＭＣ， ＫＥＩＴＨ ＪＯＵＮＧ Ｊ， ＰＩＮＥＬＬＯ Ｌ． Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｎ ＣＲＩＳＰＲ?ｃａｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ［Ｊ］． ＣＲＩＳＰＲ Ｊ， ２０１８， １（２）：１５９ －１７０．

 

［２５］　ＨＡＡＰＡＮＩＥＭＩ Ｅ， ＢＯＴＬＡ Ｓ， ＰＥＲＳＳＯＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲ?Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｐ５３?ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２０１８， ２４（７）： ９２７ －９３０．

 

內容來源：中國新藥雜志２０２５ 年第３４ 卷