1. 實驗原理

小鼠心臟灌流實驗是通過血液循環(huán)系統(tǒng)將固定液或生理鹽水注入體循環(huán)，以清除血液并固定組織的實驗方法。這種方法可以有效去除血液對后續(xù)實驗（如組織切片、免疫染色、基因測序等）的干擾，同時保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2. 實驗材料

耗材：1 mL注射器、 輸液器針頭、止血鉗、鑷子、剪刀、導(dǎo)管、解剖工具（如眼科鑷、精細剪等）

試劑：生理鹽水、固定液（4%多聚甲醛）、麻醉劑（三溴乙醇）

設(shè)備：蠕動泵、解剖臺

3 實驗步驟

實驗流程：麻醉小鼠→固定小鼠→打開胸腔→生理鹽水灌流→固定液灌流→組織取材

3.1 麻醉小鼠

量小鼠體重，按0.2 mL/10 g注射三溴乙醇（1.25%），一般一只小鼠0.6 mL左右，通常在5 min內(nèi)完全麻醉，麻醉效果可維持30 min。

3.2 固定小鼠

確認小鼠進入深度麻醉狀態(tài)（捏尾尖或腳趾無反應(yīng)），將小鼠四肢（掌根、腳跟）固定在解剖臺上，注意固定緊實，不然小鼠劇烈掙扎容易松動。

3.3 打開胸腔

打濕腹部毛發(fā)，用鑷子提起腹部的皮毛，用剪刀剪開腹部（注意不要剪到器和腸道），剪開橫隔膜（避免剪到肺臟），剪斷肋骨，充分暴露心臟。

3.4 生理鹽水灌流

剪開右心耳，輸液器針頭從心尖刺入左心室， 以15 mL/min的流速灌注生理鹽水，持續(xù)約3 min。

3.5 固定液灌流

觀察肝臟、爪子是否變白，若變白表示血液已清除，再灌流生理鹽水1 min左右更換固定液（4%多聚甲醛）。以大約10 mL/min的速度灌注固定液，持續(xù)約5 min。觀察小鼠肌肉收縮、尾巴擺動等現(xiàn)象，若觀察到肌肉收縮、尾巴擺動就表示灌流環(huán)路是暢通的。

3.6 組織取材

等待小鼠肝臟和四肢變硬后表示灌流完成，小心剪取需要的組織，若表面有殘留的血液，用生理鹽水沖洗干凈，之后轉(zhuǎn)移到固定液（4%多聚甲醛）中，建議保存時間不要超過1周，避免后續(xù)實驗組織自發(fā)熒光增強。

4. 注意事項

進針方向，在左心室進針時，需確保針頭進入左心室而非右心室，避免刺穿心室間隔。

灌流速度，灌流速度不宜過快，以免灌流液進入肺臟。

組織保存，灌流后的組織需及時放入4℃固定液中保存，防止組織降解。

注意是要進行體循環(huán)，肺循環(huán)會導(dǎo)致血液在體內(nèi)的殘留，沒有體循環(huán)效果好。

附：體循環(huán)路徑：左心室 →主動脈→全身各級動脈→毛細血管網(wǎng)→各級靜脈→上、下腔靜脈→右心房

肺循環(huán)路徑：右心室→肺動脈→肺部毛細血管網(wǎng)→肺靜脈→左心房

5. 參考資料

[1] 黃維,楊曉蘭,馬育,等.交聯(lián)瓊脂包嵌凹凸棒微囊重復(fù)大鼠血液灌流中生物相容性的初探[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003,(12):1079-1081.

[2] Rana A, Massa PT, Chen XJ. A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System. J Vis Exp. 2022;(179):10.3791/63386.