1. 引言

多肽作為生物制藥、診斷試劑和功能研究的重要分子，其純化效率直接影響下游應用效果。反相高效液相色譜（RP-HPLC/RPLC）因其高分辨率、重現性和靈活性，成為多肽分離的首選技術。固定相（色譜填料）的選擇是多肽分離的核心，需綜合考慮多肽性質、分離目標及工藝效率。

2. 反相色譜分離多肽的基本原理

反相色譜通過多肽與固定相之間的疏水相互作用實現分離。固定相表面鍵合的非極性官能團（如C18、C8）與多肽的疏水區域結合，流動相中有機溶劑（乙腈、甲醇）梯度增加時，疏水性較弱的多肽先被洗脫，疏水性強的多肽保留更久。分離效率取決于：

固定相化學性質（鍵合相類型、碳載量、封端處理）

物理結構（粒徑、孔徑、比表面積）

多肽特性（疏水性、電荷、分子量、二級結構）

3. 反相固定相的關鍵選擇參數

3.1 鍵合相類型

C18（十八烷基）：

高疏水性，適合長鏈、疏水性強的多肽（如富含Leu、Ile、Phe、Val、十八烷二酸或二十烷二酸等）。高碳載量提供強保留，但可能導致疏水性強肽的洗脫困難，需高有機相比例。當載樣量較大或是所選的流動相體系對該樣品溶解性差時可能因樣品保留太強導致樣品洗脫不完全，需多次沖柱，為避免此類現象發生可選擇C8或是C4等保留較差一點的鍵合相。

C8（辛基）：

中等疏水性，適合中等疏水性多肽或需縮短分離時間的場景。

對極性多肽保留較弱，可減少有機溶劑消耗。

C4（丁基）：

低疏水性，適用于短肽、親水性多肽或易聚集的疏水多肽（如跨膜肽）。

減少強疏水相互作用，降低變性風險。

苯基/極性嵌入相：

通過π-π作用或極性基團增強對含芳香族殘基或多肽構象的選擇性。

選擇策略：

多肽疏水性（可通過軟件預測或實際測試）決定鍵合相疏水強度。

若目標多肽疏水性差異小，優先選擇C18以提高分辨率；若需快速洗脫，選擇C8或C4。

3.2 粒徑與柱效

小粒徑（1.7–3 μm）：

高柱效（理論塔板數高），適合復雜樣品的高分辨率分離。

需配合超高效液相色譜（UHPLC）系統以承受高背壓。

大粒徑（5–10 μm）：

低背壓，適合常規HPLC系統或制備級純化。

核殼（表面多孔）顆粒：

平衡柱效與背壓，適合快速分析（如2.7 μm核殼顆粒）。

3.3 孔徑與多肽尺寸

大孔徑（300 Å）：

適合大分子多肽（>5 kDa）或易形成聚集體，確保傳質充分。

小孔徑（100–120 Å）：

適合小肽（<5 kDa），提供更大的比表面積以增強保留。如肽序很親水固定相不易保留建議選擇100 Å

3.4 封端處理與表面化學

封端處理：減少未鍵合硅羥基的殘留，降低多肽與固定相的次級相互作用（如離子交換），改善峰形。如裸露氨基較多的建議選擇封端效果較好的固定相。

雜化顆粒：提升pH耐受性（pH 1–12），適合極端pH條件（如酸性流動相抑制多肽電離）。

4. 快速分離的優化策略

梯度斜率優化：

增加梯度斜率（如3%乙腈/min→5%乙腈/min）可縮短運行時間，但需平衡分辨率。

使用短柱（50–100 mm）配合小粒徑填料，加快洗脫。

溫度控制：

升高柱溫（40–60℃）可降低流動相粘度，提高傳質速率，減少分析時間。

表面修飾技術：

選擇具有極性嵌入基團（如酰胺）的固定相，減少疏水塌陷風險，允許低有機相起始比例，縮短梯度時間。

5. 結論

反相固定相的選擇需系統分析多肽特性（疏水性、分子量、穩定性）與分離目標（分析/制備、速度/分辨率）。通過結合鍵合相類型、粒徑、孔徑的優化，并調整梯度條件與溫度，可實現多肽的高效純化。未來發展趨勢包括新型雜化材料、單克隆抗體修飾固定相以及人工智能輔助填料設計。