一、流動相組成的關鍵作用

（一）有機溶劑的選擇

在多肽純化中，常用的有機溶劑如乙腈、甲醇等，它們在流動相中的比例對多肽的分離起著關鍵作用。乙腈具有較低的黏度和較高的洗脫強度，能夠有效地調節多肽在固定相和流動相之間的分配系數。當乙腈比例增加時，流動相的洗脫能力增強，多肽在色譜柱上的保留時間縮短。例如，對于疏水性較強的多肽，適當提高乙腈比例，可以使其更快地從固定相上洗脫下來，實現與其他雜質的分離。而甲醇雖然洗脫強度相對較弱，但它的極性與乙腈有所不同，在某些情況下，使用甲醇 - 水體系作為流動相，能夠對特定結構的多肽產生更好的分離效果，這是因為不同的有機溶劑與多肽分子之間的相互作用方式存在差異，從而影響了多肽在色譜柱中的遷移行為。

（二）水相的影響

水相作為流動相的另一重要組成部分，不僅提供了一個極性環境，還參與了與多肽分子的相互作用。水的 pH 值可以通過添加酸或堿進行調節，進而影響多肽的電荷狀態。此外，水中的離子強度也會對多肽的分離產生影響。例如，在離子交換色譜中，通過調節水相中的鹽濃度，可以改變離子交換樹脂與多肽之間的靜電相互作用，從而實現多肽的洗脫和分離。低濃度的鹽溶液有利于多肽與離子交換樹脂的結合，而高濃度的鹽溶液則會促使多肽從樹脂上洗脫下來。

二、pH 值對多肽分離的影響

（一）多肽的電荷狀態與 pH 的關系

多肽是由氨基酸組成，氨基酸殘基上的酸性和堿性基團在不同 pH 條件下會發生質子化或去質子化反應，從而改變多肽的電荷狀態。如羧基（-COOH）在酸性條件下以質子化形式存在，而在堿性條件下則去質子化形成羧基負離子（-COO?）；氨基（-NH?）在酸性條件下質子化形成銨離子（-NH??），在堿性條件下為游離氨基（-NH?）。這種電荷狀態的變化直接影響了多肽與固定相之間的相互作用。在反相色譜中，當多肽帶電荷較多時，其與非極性固定相之間的疏水作用減弱，保留時間縮短；反之，多肽呈電中性或電荷較少時，疏水作用增強，保留時間延長。在離子交換色譜中，pH 值決定了多肽與離子交換樹脂之間的靜電相互作用，從而控制多肽的結合與洗脫。

（二）考慮多肽的穩定性

在選擇流動相 pH 時，必須充分考慮多肽的穩定性。極端的 pH 條件可能導致多肽的降解、變性或聚集。例如，在酸性過強的條件下，某些氨基酸殘基（如天冬酰胺、谷氨酰胺）可能會發生脫酰胺反應；在堿性條件下，多肽的肽鍵可能會水解。因此，需要在保證有效分離的前提下，選擇對多肽穩定性影響較小的 pH 范圍。

三、流動相添加劑的作用

（一）緩沖鹽的使用

緩沖鹽在流動相中起著維持 pH 穩定的重要作用。常用的緩沖鹽如磷酸鹽、醋酸鹽等，它們能夠抵抗外界因素對 pH 值的影響，確保在整個分離過程中流動相的 pH 保持相對恒定。這對于保證多肽分離的重復性和穩定性至關重要。此外，緩沖鹽的種類和濃度還會影響多肽與固定相之間的相互作用。例如，在反相色譜中，某些緩沖鹽可以與多肽分子形成離子對，從而改變多肽的保留行為，提高分離效果。

（二）離子對試劑的應用

離子對試劑常用于反相色譜中，以改善對強極性多肽的分離效果。離子對試劑能夠與多肽分子上的離子基團形成離子對，使其在非極性固定相上的保留增加。例如，對于帶正電荷的多肽，使用烷基磺酸鹽等陰離子型離子對試劑，可以與多肽形成離子對，增強其與 C18 固定相之間的疏水作用，從而實現更好的分離。然而，離子對試劑的使用也需要謹慎，因為它們可能會對色譜柱造成一定的損傷，并且在后續的樣品處理中需要去除。

（三）其他添加劑

除了緩沖鹽和離子對試劑外，還有一些其他添加劑可用于改善多肽的分離效果。例如，在流動相中加入少量的三氟乙酸（TFA），它可以作為一種質子供體，調節流動相的 pH 值，同時還能與多肽分子形成弱相互作用，改善峰形。此外，一些表面活性劑也可以添加到流動相中，用于改變多肽分子的表面性質，增強其在固定相和流動相之間的分配差異，從而提高分離度。

綜上所述，在多肽純化過程中，流動相的篩選是一個復雜而關鍵的環節。需要綜合考慮流動相的組成、pH 值、添加劑等因素對多肽分離的影響，通過合理的選擇和優化，才能實現高效、高純度的多肽分離。