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嘉峪檢測網 2025-02-13 08:24
摘 要: 建立高效液相色譜法測定異丙醇-水溶液中利血平含量。采用Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)分離,以甲醇-水溶液(體積比為8∶2)作為流動相等度洗脫,采用波長為268 nm的二極管陣列檢測器,流量為0.5 mL/min,柱溫為40 ℃。利血平的質量濃度在0.2~10 μg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好,相關系數為0.999 9,檢出限為0.05 μg/mL。利血平的加標回收率為100.20%~100.39%,測定結果的相對標準偏差為0.43%~0.81%(n=6)。該方法簡單可靠,重復性好,適用于異丙醇-水溶液中利血平含量的測定。
關鍵詞: 利血平; 高效液相色譜法; 異丙醇-水溶液; 方法驗證
利血平是從蘿芙木屬多種植物中提出的一種吲哚型生物堿[1],具有降低血壓、減緩心率和抑制中樞神經系統等作用[2],由于其降壓效果顯著、價格低廉而深受高血壓患者青睞。
高效液相色譜法是一種以液體作為流動相的分離與分析方法,具有強選擇性、高準確性、可量化和定量分析等優點[3-4],在分離、鑒別和定量目標組分方面發揮了重要作用。
目前對利血平含量的檢測方法主要包括分光光度法[5]、液相色譜-質譜聯用法[6]、高效液相色譜法[7]等。其中分光光度法操作簡單、成本低,但需加耦合試劑進行顯色反應后才能進行檢測,前處理方法復雜;液相色譜-質譜聯用法方法快速、準確,能同時進行定性、定量分析,但對設備和操作技術要求較高,費用大;高效液相色譜法精密度高,準確性強,方法簡便、選擇性好、操作方便,是研究者的首選方法。目前對于利血平檢測方法的優化研究僅包含波長、色譜柱、流動相、柱流速和柱溫中的一項或幾項,尚未有文獻專門針對利血平的最優色譜條件進行全面的分析。
筆者采用高效液相色譜法對利血平含量的測定進行了以上五個方面的優化。以異丙醇-水溶液為溶劑,建立了一種簡單、高效、準確可行的分析方法。該方法可用于異丙醇-水溶液中利血平標準物質均勻性及穩定性的檢測,確保標準物質的量值不受方法影響,同時為今后利血平的檢測提供了數據支撐和理論依據。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀:1260 Infinity型,二極管陣列檢測器,美國安捷倫科技有限公司。
電子天平:ME235S型,感量為0.01 mg,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。
甲醇、乙腈:均為色譜純,德國默克公司。
異丙醇:質譜純,德國默克公司。
利血平純度標準物質:純度(質量分數)為99.3%,U=0.5%,k=2,標準物質編號為GBW (E)090901,廣東省計量科學研究院。
超純水機:Milli-Q系統,美國密理博公司。
異丙醇-水溶液:異丙醇與水的體積比為1∶1。
1.2 色譜條件
色譜柱:Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,美國安捷倫科技有限公司);柱溫:40 ℃;進樣體積:20 μL;流動相:甲醇-水溶液(體積比為8∶2,下同);洗脫方式:等度洗脫;柱流量:0.5 mL/min;檢測器:二極管陣列檢測器(DAD檢測器);檢測波長:268 nm。
1.3 溶液配制
標準儲備溶液:控制室溫為(20±2) ℃,準確稱取10.12 mg的利血平純度標準物質,根據重量-容量法,用異丙醇-水溶液將其稀釋至100 mL,制得質量濃度為100 µg/mL的標準儲備溶液。
利血平樣品溶液:準確移取2 mL標準儲備溶液于200 mL容量瓶中,用異丙醇-水溶液稀釋至標線,制得質量濃度為1 µg/mL的利血平樣品溶液。
空白溶液:精密移取同體積的異丙醇與超純水于容量瓶中,混合均勻。
系列標準工作溶液:移取標準儲備溶液,通過重量法將其逐級稀釋,制得質量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL的系列標準工作溶液。
1.4 實驗方法
首先根據二極管陣列檢測器的光譜掃描,選擇最佳吸收波長,采用單因素實驗進行條件分析,通過分析色譜柱的類型、流動相的種類及比例、柱流速及柱溫,根據樣品與雜質的分離度、色譜峰面積的大小和出峰時間的長短等,依次選擇最優分析條件[8]。為確保優化后的分析條件準確可靠,還需對優化后的條件進行驗證。通過方法學試驗[9-11]進行考察,驗證優化后的分析條件是否可行。
2、 結果與討論
2.1 分析方法優化
2.1.1 波長的選擇
選擇光譜掃描模式,在波長為190~400 nm條件下,對利血平溶液進行全掃描。利血平樣品溶液在不同波長下的光譜圖如圖1所示,從圖1中可以看出,溶液在218、268、292 nm處均有強吸收。由于292 nm處是肩峰,溶劑在低波段218 nm處有紫外吸收,易對檢測結果產生影響,且在該波段基線噪聲和漂移相對較大,雜質峰較多,因此218 nm和292 nm均不適合作為分析條件[12]。波長為268 nm時峰形平緩,干擾相對較少,因此選擇檢測波長為268 nm。
圖1 利血平樣品溶液在不同波長下的光譜圖
Fig. 1 Spectrogram of reserpine sample solution at different wavelengths
2.1.2 色譜柱的選擇
設置波長為268 nm,考察SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)、Poroshell 120 EC-C18(150 mm×4.6 mm,4 μm)3種不同類型的色譜柱的分離效果,分離色譜圖如圖2所示。從圖2中可以看出,由于SB-C18的色譜柱較長,利血平的出峰時間較長(12.33 min),同時相比較其他兩個色譜柱,色譜峰面積也較小,峰形較差,有拖尾。Eclipse Plus C18和Poroshell 120 EC-C18 2種色譜柱的出峰時間和峰面積相差不大,Eclipse Plus C18的出峰時間稍短,面積稍大,且峰形相對于Poroshell 120 EC-C18較好,因此最終選擇色譜柱為Eclipse Plus C18色譜柱。
圖2 不同型號色譜柱的分離色譜圖
Fig. 2 Separation chromatogram of different types of column
2.1.3 流動相的選擇
流動相的選擇直接影響色譜峰的分離度[13],選擇合適的流動相,既要將色譜峰與雜質峰完全分離開,又要盡可能縮短檢測時間,增大峰面積。
根據文獻[14-16]知,利血平檢測的流動相種類一般為甲醇-水或乙腈-水體系。考察流動相為甲醇-水(9∶1,體積比,下同)、甲醇-水(8∶2)、乙腈-水(8∶2)、乙腈-水(7∶3)時的分離效果。結果表明,隨著甲醇或乙腈比例的降低,出峰時間逐漸增長,在流動相為甲醇-水(9∶1)和乙腈-水(8∶2)時,利血平的峰與雜質峰未能分開,且峰型較差,峰有前伸或者拖尾;流動相為甲醇-水(8∶2)和乙腈-水(7∶3)時,利血平色譜峰較平緩,峰型較好。其中流動相為甲醇-水(8∶2)時,峰面積略大,出峰時間較短,因此選擇甲醇-水(8∶2)作為流動相。
2.1.4 柱流量的選擇
柱流量的大小直接影響色譜峰的出峰時間和峰面積。其他初始條件不變,考察不同柱流量(0.25、0.50、0.75、1.00 mL/min)時的色譜分離情況。結果表明,隨著流量的減小,出峰時間逐漸增長,色譜峰形漸寬,峰面積逐漸增大,峰面積的大小受流量影響顯著。柱流量為0.25 mL/min時出峰時間長導致峰形太寬,影響分離效果。綜合考慮,最終選擇柱流量為0.50 mL/min。
2.1.5 柱溫的選擇
由于液相色譜柱的壽命一般在40 ℃下可保持最優,考察色譜柱的柱溫為30、35、40 ℃時色譜柱的分離情況,結果表明,隨著柱溫的升高,出峰時間相差不大,峰面積逐漸增大,因此最終選擇色譜柱的柱溫為40 ℃。
2.2 專屬性試驗
在1.2儀器工作條件下,將空白溶液、樣品溶液以及標準物質對照品進樣測定,色譜圖如圖3所示。從圖3中可以看出,空白溶液對測定結果無干擾,對照溶液和樣品溶液對應峰的保留時間一致,該方法專屬性良好。
圖3 空白溶液、樣品溶液和對照品溶液色譜圖
Fig. 3 Chromatogram of blank solution,sample solution and control solution
2.3 分析方法驗證
2.3.1 線性關系及檢出限
將系列標準工作溶液在1.2儀器工作條件下進行分析,以質量濃度(x)為橫坐標,色譜峰面積積分值(y)為縱坐標,繪制標準工作曲線。按信噪比為3對應的利血平濃度確定方法檢出限,信噪比為10對應的利血平濃度確定方法定量限。結果表明,利血平的質量濃度在0.2~10 μg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好。利血平溶液的線性方程為y=55.453x-6.906 6,相關系數為0.999 9。方法檢出限為0.05 μg/mL,定量限為0.16 μg/mL。
2.3.2 加標回收和精密度試驗
選取異丙醇-水溶液空白樣品,分別置于容量瓶中,6份為一組,分別加入標準儲備溶液50、250、1 000 μL,制得加標量分別為1、5、20 μg 3個加標水平的加標樣品溶液,每個加標水平平行測定6次,在1.2儀器工作條件下進行分析。加標回收及精密度試驗結果見表1。由表1可知,利血平溶液的平均回收率為100.20%~100.39%,相對標準偏差為0.43%~0.81%(n=6)。表明該方法的精密度良好、準確可靠。
表1 加標回收和精密度試驗結果
Tab. 1 Results of standard recoveries and precision test
2.3.3 穩定性試驗
在1.2儀器工作條件下,在不同的時間內測定相同濃度的異丙醇-水溶液中利血平。每個樣品測量3次,取平均值為最終測量結果,測量時間為5天,每隔兩天測量一次,穩定性試驗結果見表2。由表2可知,在不同的時間內測量結果未發生明顯變化,表明該方法的穩定性良好。
表2 穩定性試驗結果
Tab. 2 Results of stability test
3、 結語
通過色譜條件的優化,建立了高效液相色譜法測定異丙醇-水溶液中利血平,該方法精密度高、準確度高、穩定性強,可為今后利血平溶液的檢測提供科學依據和參考。
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來源:化學分析計量