一、細胞內(nèi)一氧化氮（NO）的簡介

細胞內(nèi)一氧化氮（NO）是一種在細胞內(nèi)由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成小分子氣體，通常有三種亞型包括神經(jīng)型（nNOS）、誘導型（iNOS）和內(nèi)皮型（eNOS）。nNOS和eNOS在生理條件下通常會產(chǎn)生少量的NO維持正常的生理功能，比如在血管內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)血管張力等的作用。

另外，iNOS在炎癥等病理刺激下可大量產(chǎn)生NO；在巨噬細胞炎癥模型中NO具有殺菌作用，因此在一些因素導致的炎癥反應中我們通常會檢測iNOS或者NO的含量作為細胞表型變化的指標之一，但因iNOS的變化不明顯通常檢測NO的含量。

二、細胞內(nèi)NO的檢測方法

1、熒光探針法：常用的熒光探針有DAF-FMDA等。

（1）原理：DAF-FMDA本身沒有熒光，進入細胞后被細胞內(nèi)酯酶水解生成具有熒光特性的DAF-FM。在有NO存在時，DAF-FM會與NO反應生成具有更強熒光的三唑熒光產(chǎn)物，通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或熒光分光光度計等儀器檢測熒光強度，從而反映細胞內(nèi)NO的水平。

（2）優(yōu)點：靈敏度較高，能夠?qū)崟r檢測細胞內(nèi)NO的動態(tài)變化；對細胞損傷較小。

（3）缺點：一些細胞內(nèi)物質(zhì)可能會對熒光探針產(chǎn)生干擾，影響檢測結(jié)果的準確性。

2、化學發(fā)光法

（1）原理：利用NO與臭氧（O?）反應生成激發(fā)態(tài)的NO?，當激發(fā)態(tài)的NO?回到基態(tài)時會發(fā)出特定波長的光，通過化學發(fā)光檢測儀測量光強度來定量NO。

（2）優(yōu)點：具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測極低濃度的NO。

（3）缺點：儀器設備較為昂貴，操作相對復雜，且需要對樣本進行特殊處理。

3、比色法

（1）原理：例如使用Griess試劑，NO在體內(nèi)或體外被氧化生成硝酸鹽（NO??）和亞硝酸鹽（NO??），Griess試劑可與亞硝酸鹽反應生成有色化合物，通過分光光度計在特定波長下測量吸光度來定量亞硝酸鹽，進而間接反映NO的水平。

（2）優(yōu)點：操作相對簡單，成本較低。

（3）缺點：只能檢測NO的氧化產(chǎn)物，不能直接檢測NO本身，而且檢測的是NO的累積量，無法反映實時的NO水平。

三、比色法檢測細胞內(nèi)NO（碧云天試劑盒）

在這里我們主要介紹一下快速簡便的比色法檢測細胞內(nèi)NO的實驗步驟：

（1）從冰箱取出試劑盒使回復室溫；試劑盒中包含1M NaNO2、Griess Reagent I和II三種試劑。

（2）用RPMI 1640+10%血清FBS稀釋標準品(1-100μM)，標準品的濃度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μM。

1M NaNO2稀釋：

稀釋100×：990μL RPMI 1640+FBS+10μL 1M NaNO2(1mL 10mM NaNO2)

稀釋100×：15μL 10Mm NaNO2+1485μL RPMI 1640(1.5mL 100μM NaNO2)

以下濃度用1.5mL 100μM NaNO2進行稀釋：

（3）待測樣品處理，吸取細胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管中，12000×g，5min去除細胞碎片和其他沉淀物。

（4）按50μl /孔，在96孔板中加入標準品及樣品。

（5）按50μl/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent I。

（6）按50μl /孔，各孔中加入室溫Griess Reagent II。

（7）用酶標儀540nm測定吸光度。

圖1 標準品加入Griess Reagent I、Griess Reagent II孵育后

圖2  樣品加入Griess Reagent I、Griess Reagent II孵育后

（8）根據(jù)標準品曲線計算出樣品中一氧化氮NO的濃度。標準曲線示例如下圖：

（9）利用制備的標準曲線計算出待測樣本（細胞上清）中NO 的含量：

1）利用EXCEL將得到標準品的OD值繪制標準曲線，獲取的標準曲線的R2要求在0.99以上，否則需要重新制備標準品樣本進行檢測；

2）計算待測樣品NO的濃度，要求測得吸光度的值在標準曲線OD值范圍內(nèi)，否則需要重新制備樣品進行檢測；

3）計算X(NO濃度)：代入公式X=（Y(待測樣品吸光度值)-B）/A

4）結(jié)果分析：理論上，所測OD值與待測樣本NO的 濃度成正比。其中在標準曲線范圍內(nèi)，OD值越大，樣品產(chǎn)生的NO濃度越高，NO濃度也高顯色越深，相反顏色越淺。

四、注意事項

1、試劑的純度要高，且在有效期內(nèi)使用，避免因試劑變質(zhì)影響實驗結(jié)果。實驗用水應為去離子水或超純水，以防止水中的雜質(zhì)干擾實驗。

2、加入試劑的量要準確，且充分混勻，以保證反應的充分性和一致性。

3、及時用酶標儀檢測，控制在5min之內(nèi)。顯色反應的溫度和時間要嚴格控制，不同的顯色反應有其適宜的溫度和時間范圍，應根據(jù)具體的實驗方法進行調(diào)整。

4、進行多次平行實驗，以提高實驗結(jié)果的準確性和可靠性，并計算平均值和標準偏差等統(tǒng)計參數(shù)。

5、設置空白對照，即在不加樣品的情況下，按照相同的實驗步驟進行操作，以消除實驗系統(tǒng)自身帶來的誤差等。

6、檢測結(jié)果應在標準曲線的線性范圍內(nèi)，若超出范圍，需對樣品進行適當稀釋或濃縮后重新測定。

7、分開加樣進入96孔板時需要主要不要產(chǎn)生氣泡，產(chǎn)生氣泡時我們可以使用熱吹風機短時間消除，輕輕震動板子混勻樣品盒試劑。